產(chǎn)品名稱：pTrx-EK Expression Kit
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價格 |
| HKV101-01A | pTrx-EK Expression Kit | 1μg/20次 | 表達(dá)載體 | 960 |
產(chǎn)品描述：
本質(zhì)粒以 Nco I 線性化方式提供，請配合環(huán)凱Plus PCR 一步定向克隆試劑盒（Cat No：HKNR005）使用。Trx 是實驗室中最常用的融合標(biāo)簽之一，能夠促進(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解性和正確折疊。在需要用腸激酶 Enterokinase（Cat. No:HKPE001）切割的時候，經(jīng)常會產(chǎn)生非特異性切割，產(chǎn)生兩個標(biāo)簽帶。pTrx 通過刪除部分氨基酸序列，在保留原有 Trx 融合蛋白質(zhì)優(yōu)勢的同時，避免了非特異性酶切，使酶切結(jié)果的判斷和目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離變的更加方便。在不希望使用腸激酶切割時，可通過 Kpn I 位點引入 TEV 或其他蛋白酶切割位點。
目的基因擴(kuò)增按常規(guī)方法設(shè)計引物后，在上游引物 5'端前添加以下序列：GAC GAT GAT GAC AAG；下游引物 5′端引物前添加：TTC GGA TCC GAT ATC。
注意：5′端引物后第一個氨基酸不能為 Pro，如果是 Pro，標(biāo)簽無法切割。不希望目標(biāo)蛋白 C 端保留 His Tag 時，3′端引物 要加入終止密碼子。
產(chǎn)品特點：
改造后的 Trx 融合標(biāo)簽?zāi)軌虼龠M(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解性和正確折疊。
特異性切割，便于酶切結(jié)果的判斷和目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離。
環(huán)凱 Plus PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡便,一步完成質(zhì)粒構(gòu)建。
應(yīng)用實例：圖示下）用不同量的 EK 酶切割 pET-32a 載體（左圖）和 pTrx-EK 載體（右圖），結(jié)果顯 示 pET-32a 載體酶切后標(biāo)簽被非特異性酶切為兩個條帶。
保存溫度：-20℃
pTrx-EK Expression Kit產(chǎn)品包裝（A包裝）：
| 產(chǎn)品組成 | 體積 |
| pTrx-EK（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
| Enterokinase（10U/μl） | 50μl |
質(zhì)量保證：pTrx-EK 線性化載體經(jīng)過嚴(yán)格的自連測試以及連接效率測試，滿足下游實驗需求。
注意事項：
1）目的片段的 PCR 產(chǎn)物建議純化，避免引物二聚體等雜質(zhì)影響連接反應(yīng)。
2）目的片段與載體的摩爾比在 2:1。
3）引物設(shè)計要保證目的片段兩端有至少 15bp序列與線性化載體的兩端一致。
使用方法：
A 目的片段的獲得
目的片段通常通過 PCR 獲得。引物設(shè)計要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR擴(kuò)增 的保真度，請盡可能選用高保真酶，推薦使用 Fast PfuDNA 聚合酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每條引物長度至少在 35- 40bp，包括 5'端與載 體同源的 15b 序列以及目的片段特異性 20- 25bp 序列。
（注意：如果是表達(dá)載體克隆構(gòu)建，引物設(shè)計完成后，請注意 檢 查讀碼框是否正確。）
B 目的片段與載體的重組
C 轉(zhuǎn)化（我們建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要大于 5×106 cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下：）
1，冰上融化一支感受態(tài)細(xì)胞，輕彈管壁使細(xì)胞重懸起來。加入 10μl 的反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中，用 移液槍吹打混合，冰上放置 30 分鐘。
2，將離心管置于 42℃水浴中，熱擊 60-90 秒，迅速將離心管置于冰上，放置 2-3 分鐘。
3，向每個離心管中加入 500μl 無菌不含抗生素的LB 或 SOC 培養(yǎng)基中，37℃搖床，150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘，使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。
4，吸取 200μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含氨芐青霉素的 LB 或 SOC 固體平板上，用無菌涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全吸收，倒置培養(yǎng) 12-16 小時。
D 陽性克隆鑒定
PCR 檢測，利用高速 PCR 擴(kuò)增試劑 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接進(jìn)行菌落 PCR 鑒 定。
鑒定引物的選擇：為避免假陽性結(jié)果，我們建議一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。
pTrx-EK 結(jié)構(gòu)圖：
| T7 promoter | 686 -702 |
| lac O | 659-683 |
| Trx Tag | 123 -614 |
| Enterokinase site | 219-233 |
| T7 Terminator | 26 -72 |
| F1 origin | 5356- 5811 |
| Amp resistance | 4367- 5224 |
| ColE1 Ori | 3546 -4219 |
| lac I CDS | 1093 - 2172 |
