產(chǎn)品名稱：pGST-TEV Expression Kit
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價格 |
| HKV103-01A | pGST-TEV Expression Kit | 1μg/20次 | 表達(dá)載體 | 960 |
產(chǎn)品描述：
本質(zhì)粒以 Nde I 線性化方式提供，請配合 Plus PCR 產(chǎn) 物一步無縫克隆試劑盒使用（Cat.No. HKNR005）。GST 是實驗室中最常用的融合標(biāo)簽之一，能夠促進(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解性和正確折疊。Thormbin 作為常用的切除 GST 標(biāo)簽的蛋白酶，常常出現(xiàn)在目標(biāo)蛋白中，從而限制了其應(yīng)用。pGST-TEV 質(zhì)粒在 Thormbin 位點后引入了TEV 蛋白酶切點，極大的增加了標(biāo)簽切除的特異性。
目的基因擴增按常規(guī)方法設(shè)計引物后，在上游引物 5′端引物前添加以下序列：CTC TAC TTC CAA GGT；下游引物 5′端引物前添加：GAG TCG GAC GAA TTC。
產(chǎn)品特點：
GST 融合標(biāo)簽?zāi)軌虼龠M(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解性和正確折疊。
TEV Protease 切點的引入便于酶切結(jié)果的判斷和目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離。
Plus PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡便,完成質(zhì)粒構(gòu)建。
應(yīng)用實例：
保存溫度：-20℃
pGST-TEV Expression Kit 產(chǎn)品包裝（A包裝）：
| 產(chǎn)品組成 | 體積 |
| pGST-TEV（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
| TEV Protease（10U/μl） | 10μl |
質(zhì)量保證：pGST-TEV 線性化載體經(jīng)過嚴(yán)格的自連 測試以及連接效率測試。
注意事項：
1）目的片段的 PCR 產(chǎn)物建議純化，避免引物二聚體等雜質(zhì)影響連接反應(yīng)。
2）目的片段與載體的摩爾比在 2:1。
3）引物設(shè)計要保證目的片段兩端有至少 15bp序列與線性化載體的兩端一致。
使用方法：
A 目的片段的獲得
目的片段通常通過 PCR 獲得。引物設(shè)計要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR 擴 增的保真度，請盡可能選用高保真酶，推薦使用 Fast Pfu DNA聚合酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每條引物長度至少在 35-40bp，包括 5'端與載體同源的 15b 序列以及目的片段特異性 20-25bp 序列。
（注意：如果是表達(dá)載體克隆構(gòu)建，引物設(shè)計完成后，請注意檢 查讀碼框是否正確。）
B 目的片段與載體的重組
C 轉(zhuǎn)化（我們建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要大于 5×106 cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下：）
1，冰上融化一支感受態(tài)細(xì)胞，輕彈管壁使細(xì)胞重懸起來。加入 10μl 的反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中，用移液 槍吹打混合，冰上放置 30 分鐘。
2，將離心管置于 42℃水浴中，熱擊 60-90 秒，迅速將離心管置于冰上，放置 2-3 分鐘。
3，向每個離心管中加入 500μl 無菌不含抗生素的LB 或 SOC 培養(yǎng)基中，37℃搖床，150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘，使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。
4，吸取 200μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含氨芐青霉素的 LB 或 SOC 固體平板上，用無菌涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全吸收，倒置培養(yǎng) 12-16 小時。
D 陽性克隆鑒定
PCR 檢測，利用高速 PCR 擴增試劑 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接進(jìn)行菌落 PCR 鑒定。
鑒定引物的選擇：為避免假陽性結(jié)果，我們建議 一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。
pGST 結(jié)構(gòu)圖：
| Tac promoter | 184 -212 |
| GSTTag | 258 -932 |
| TEVsite | 933 -956 |
| Amp resistance | 1380-2240 |
| pBR322 Ori | 2395-3014 |
| lacI CDS | 3444-4403 |
| lacZ alpha | 4526-4969 |
