產(chǎn)品名稱：pAvi-C Expression Kit
產(chǎn)品編號(hào)與包裝規(guī)格：
| 編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價(jià)格 |
| HKV104-01A | pAvi-C Expression Kit | 1μg/20次 | 表達(dá)載體 | 750 |
產(chǎn)品描述：
pAvi-C 專為目標(biāo)蛋白 C 端融合 Avi Tag 設(shè)計(jì)，是預(yù)先用 Nde I 線 性 化 的 載 體 ， 可 配 合 Plus PCR 一 步 定 向 克 隆 試 劑 盒 （Cat.No：HKNR005）使用，用于在大腸桿菌中快速高效表達(dá)和 蛋白質(zhì) Biotin 標(biāo)記。為保證標(biāo)記效率，請(qǐng)選擇高表達(dá) Biotin 化酶的 宿主菌 Biotin Competent Cell（Cat.No：HKV207）。
目的基因擴(kuò)增按常規(guī)方法設(shè)計(jì)引物后，在 5′端引物前添加以 下序列：GAA GGA GAT ATA CAT；3′端引物前添加：GAT GTC GTT CAG GCC 。
注意：5′端引物從第一個(gè)氨基酸開始（ATG），3′端引物不要 包含終止密碼子。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
pAvi-C 用于在大腸桿菌中快速高效表達(dá)和蛋白質(zhì) Biotin 標(biāo)記。
PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡(jiǎn)便,完成質(zhì)粒構(gòu)建。
保存溫度：-20℃
pGST-TEV Expression Kit 產(chǎn)品包裝（A包裝）：
| 產(chǎn)品組成 | 體積 |
| pAvi-C（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
質(zhì)量保證：pAvi-C 線性化載體經(jīng)過嚴(yán)格的自連測(cè)試 以 及連接效率測(cè)試，滿足下游實(shí)驗(yàn)需求。
注意事項(xiàng)：
1）目的片段的 PCR 產(chǎn)物建議純化，避免引物 二聚體等雜質(zhì)影響連接反應(yīng)。
2）目的片段與載體的摩爾比在 2:1。
3）引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端一致。
使用方法：
A 目的片段的獲得
目的片段通常通過 PCR 獲得。引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩 端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR 擴(kuò)增 的保真度，請(qǐng)盡可能選用高保真酶，推薦使用 Fast Pfu DNA 聚合 酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每條引物長(zhǎng)度至少在 35- 40bp，包括 5'端 與載體同源的 15b 序列以及目的片段特異性 20-25bp 序列。
（注意：如果是表達(dá)載體克隆構(gòu)建，引物設(shè)計(jì)完成后，請(qǐng)注意 檢 查讀碼框是否正確。）
B 目的片段與載體的重組
C 轉(zhuǎn)化（我們建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要大于 5×106 cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下：）
1，冰上融化一支感受態(tài)細(xì)胞，輕彈管壁使細(xì)胞重懸 起來。加入 10μl 的反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中，用移 液 槍吹打混合，冰上放置 30 分鐘。
2，將離心管置于 42℃水浴中，熱擊 60-90 秒，迅 速將離心管置于冰上，放置 2-3 分鐘。
3，向每個(gè)離心管中加入 500μl 無菌不含抗生素的 LB 或 SOC 培養(yǎng)基中，37℃搖床，150rpm 振蕩培 養(yǎng) 45 分鐘，使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達(dá)，菌體復(fù) 蘇。
4，吸取 200μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含氨芐青霉素的 LB 或 SOC 固體平板上，用無菌涂布棒將細(xì) 胞均勻涂開，將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完 全吸收，倒置培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。
D 陽性克隆鑒定
PCR 檢測(cè)，利用高速 PCR 擴(kuò)增試劑 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接進(jìn)行菌落 PCR 鑒定。
鑒定引物的選擇：為避免假陽性結(jié)果，我們 建議一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目 的 片段特異性引物。
PAvi-C 結(jié)構(gòu)圖：
| T7 promoter | 27-43 |
| lac O | 46-70 |
| Avi Tag | 118-162 |
| T7 Terminator | 257-303 |
| F1 origin | 340-795 |
| Kan resistance | 891-1703 |
| pBR322 ori | 1799-2472 |
| lacI CDS | 3846-492 |
