產品名稱：pSec Expression Kit
產品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 產品名稱 | 規(guī)格 | 產品介紹 | 價格 |
| HKV106-01A | pSec Expression Kit | 1μg/20次 | 表達載體 | 750 |
產品描述：
pSec 專為目標蛋白在大腸桿菌中高效分泌表達設計，是預先用 Xho I 線性化的載體，可配合 Plus PCR 產物一步無縫克隆試劑盒 （Cat.No：HKNR005）使用。外源蛋白在大腸桿菌中表達容易形成包涵體，使獲得有生物學活性的蛋白增加困難。同時大腸桿菌細胞內為還原環(huán)境，目標蛋白二硫鍵無法形成。周質分泌是獲得正確折疊的目標蛋白質的有效途徑，常見表達載體往往由于蛋白表達過快，目標蛋白來不及正確折疊和分泌而形成包涵體。該質粒適用于阿拉伯糖誘導，有較強的劑量依賴性。合適的阿拉伯糖濃度能夠在保障表達效率的同時獲得有效的蛋白質分泌。
目的基因擴增按常規(guī)方法設計引物后，在上游引物 5′端引物前添加以下序列：CCG GCG ATG GCC ATG；下游引物 5′端引物前添加：CGC GGC CGC AAG CTT。
注意：5′端引物從第一個氨基酸不是甲硫氨酸（ATG）時，可使用 CAG CCG GCG ATG GCC。不希望目標蛋白 C 端保留 His Tag 時，3′端引物需要加入終止密碼子。
產品特點：
pSec 專為目標蛋白在大腸桿菌中高效分泌表達設計。
Plus PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡便，一步完成質粒構建。
保存溫度：-20℃
pSec Expression Kit 產品包裝（A包裝）：
| 產品組成 | 體積 |
| pSec（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
質量保證：pSec 線性化載體經過嚴格的自連測試以及連接效率測試，滿足下游實驗需求。
注意事項：
1）目的片段的 PCR 產物建議純化，避免引物二聚體等雜質影響連接反應。
2）目的片段與載體的摩爾比在 2:1。
3）引物設計要保證目的片段兩端有至少 15bp序列與線性化載體的兩端一致。
使用方法：
A 目的片段的獲得
目的片段通常通過 PCR 獲得。引物設計要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR擴增的保真度，請盡可能選用高保真酶，推薦使用 Fast Pfu DNA 聚合酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每條引物長度至少在 35- 40bp，包括 5'端與載體同源的 15b 序列以及目的片段特異性 20- 25bp 序列。
（注意：如果是表達載體克隆構建，引物設計完成后，請注意 檢 查讀碼框是否正確。）
B 目的片段與載體的重組
C 轉化（我們建議所使用的感受態(tài)細胞效率要大于5×106 cfu/μg。轉化步驟如下：）
1，冰上融化一支感受態(tài)細胞，輕彈管壁使細胞重懸起來。加入 10μl 的反應液到感受態(tài)細胞中，用移液 槍吹打混合，冰上放置 30 分鐘。
2，將離心管置于 42℃水浴中，熱擊 60-90 秒，迅速將離心管置于冰上，放置 2-3 分鐘。
3，向每個離心管中加入 500μl 無菌不含抗生素的LB 或 SOC 培養(yǎng)基中，37℃搖床，150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘，使質粒上氨芐抗性基因表達，菌體復蘇。
4，吸取 200μl 已轉化的感受態(tài)細胞，加到含氨芐青霉素的 LB 或 SOC 固體平板上，用無菌涂布棒將細胞均勻涂開，將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全吸收，倒置培養(yǎng) 12-16 小時。
D 陽性克隆鑒定
PCR 檢測，利用高速 PCR 擴增試劑 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接進行菌落 PCR 鑒定。
鑒定引物的選擇：為避免假陽性結果，我們建議一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。
pSec 結構圖：
| pBAD promoter | 3 - 277 |
| pelB leader | 319-435 |
| rrnB Terminator | 456-881 |
| Amp resistance | 974-1834 |
| pBR322 ori | 1979-2652 |
| AraC CDS | 3183-4085 |
