產(chǎn)品名稱(chēng)：sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit
中文名稱(chēng)：sgRNA體外一步轉(zhuǎn)錄試劑盒
產(chǎn)品編號(hào)與包裝規(guī)格：
| 編號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價(jià)格 |
| HKE369 | sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit | 10次 | crispr基因編輯（一步法sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒） | 1275 |
產(chǎn)品描述：
CRISPR/Cas9 是 一 種 來(lái) 源 于 細(xì) 菌 獲 得 性 免 疫 的 由 RNA 指 導(dǎo) Cas9 蛋 白 對(duì) 靶 向 基 因 進(jìn) 行 編 輯 的 技 術(shù) 。 CRISPR/Cas9 的切割是通過(guò)向?qū)?RNA(gRNA)與打靶基因組位置之間約 20bp 堿基的配對(duì)，且打靶序列的 3′端需要有 PAM 結(jié)構(gòu)(NGG)，再引導(dǎo) Cas9 作用實(shí)現(xiàn)的。CRISPR/Cas9 與靶位點(diǎn)識(shí)別的特異性主要依賴于gRNA與靠近PAM 處 10~12 bp堿基的配對(duì)，而其余遠(yuǎn)離PAM 處8~10 bp 堿基的錯(cuò)配對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別影響不明顯，這導(dǎo)致了CRISPR/Cas9 存在一定的脫靶性，可能發(fā)生非特異性切割，引起基因組非靶向位點(diǎn)的突變，這樣會(huì)造成研究結(jié)果的不確定性以及 研究工作量的大量增加。環(huán)凱生物CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)能有效解決這一問(wèn)題。
sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit（一步法sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒）能夠一步法體外高效轉(zhuǎn)錄不同的 sgRNA 片段，進(jìn)一步通過(guò) sgRNA 體外篩選及基因型鑒定試劑盒（Cat.No:HKE370）篩選出脫靶率低的 sgRNA，用 于后續(xù)科研實(shí)驗(yàn)。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
一步法高效轉(zhuǎn)錄不同的 sgRNA 片段，操作簡(jiǎn)單快捷；
sgRNA 產(chǎn)量可達(dá) 10-30μg。
保存條件：-20℃保存，或-80℃長(zhǎng)期保存。
sgRNA In Vitro one-step Transcription Kit 產(chǎn)品組成：
| 產(chǎn)品組成 | 體積 |
| 2×sgRNA Reaction Buffer | 150 μL |
| Enzyme Mix | 20 μL |
| DNase I(2U/μL) | 10 μL |
| RNase Free Water | 1 mL |
流程模式：
操作步驟：
I，sgRNA 模板擴(kuò)增
擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)（選取Target DNA序列PAM（NGG）的5'端20 bp 進(jìn)行正向（F）引物設(shè)計(jì)，引物結(jié)構(gòu)包含T7 promoter（20 bp）、Target DNA 片 段（20 bp）和實(shí)際與反向引物結(jié)合的片段（21 bp）。引物設(shè)計(jì)如下：）
II，sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄體系
依次加入以下反應(yīng)組分配制轉(zhuǎn)錄體系：
| 2×sgRNA Reaction Buffer | 10 μL |
| 正向引物(10 μM) | 2 μL |
| Enzyme Mix | 2 μL |
| RNase Free Water | To 20 μl |
37 ℃保溫 1 h、70℃保溫 10 min
注： 轉(zhuǎn)錄時(shí)間0.5-2 h 即可，如需得到更多 sgRNA，可適當(dāng)延長(zhǎng)至 3 h。
III，sgRNA 純化
模板 DNA 的去除：向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加 1μL DNase Ⅰ，37°C 反應(yīng)10 min，以去除 DNA 模板，將反應(yīng)產(chǎn)物放入 75℃反應(yīng) 10 min， 得到 的 sgRNA 置于-20℃保存。sgRNA 可直接用于切割，如需純化，可選擇以下 sgRNA 純化步驟，但 sgRNA 會(huì)有所 損失。
sgRNA 純化(可選)：
1. 轉(zhuǎn)錄體系 20 μL 用 RNase Free Water補(bǔ)至 300 μL，加入等體積酚?氯仿?異戊醇（25:24:1），充分混合后， 12000 rpm，4°C 離心 15 min。
2. 取上清，加入 300μ L 氯仿，充分混勻后，12000r pm，4℃離心 5 min。
3. 取上清約 200 μL，為提高回收量，下層可再加入 100 μL RNase Free Water，充分混合后，4℃離心 5 min， 取上清。
4. 將兩次取的上清合并，總體積約 300~350 μL，加入 2 倍體積的異丙醇和 1/10 體積的用 RNase Free Water 配置的 3M NaAc，-80°C 沉淀過(guò)夜。
5. 離心取沉淀，加入 1 mL RNase Free Water配制的 75%乙醇，洗滌兩次。
6. 用 20 μL RNase Free Water溶解 RNA，電泳檢測(cè)質(zhì)量并進(jìn)行濃度測(cè)定。
應(yīng)用實(shí)例：
圖例一：使用一步法sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄 試劑盒轉(zhuǎn)錄sgRNA，大小為97 nt。
泳道1：DL2000；
泳道 2、3、4：sgRNA
圖例二：將轉(zhuǎn)錄出的sgRNA 做體外 切割檢測(cè)。
泳道 1：DL2000；
泳道 2 、3 ： sgRNA 切割后條帶 1500bp、1000bp、500bp
