細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)液顏色變化原因
發(fā)布時(shí)間：2023-06-02 瀏覽次數(shù)：1773
培養(yǎng)基的顏色主要來(lái)自酚紅，酚紅指示顏色非常靈敏，pH值范圍為6-8，顏色由黃變?yōu)樽霞t。為了培養(yǎng)方便，能讓我們直觀地感覺(jué)培養(yǎng)液的狀況，加入酚紅后，如果培養(yǎng)液偏酸，就顯示偏黃色，偏堿性則會(huì)顯示偏紫色。一般來(lái)說(shuō)，污染細(xì)菌或者長(zhǎng)時(shí)間不換液時(shí)，培養(yǎng)基變成黃色，主要是因?yàn)榧?xì)菌和細(xì)胞過(guò)度增長(zhǎng)，產(chǎn)生了酸性物質(zhì)。開(kāi)封后的培養(yǎng)基保存在4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的二氧化碳會(huì)逐漸溢出，pH偏堿性，所以培養(yǎng)基就偏紫色了。
偏紫色的培養(yǎng)基，可以通入無(wú)菌過(guò)濾的二氧化碳，調(diào)整pH值后繼續(xù)使用。長(zhǎng)時(shí)間沒(méi)用完的堿性培養(yǎng)基不建議繼續(xù)使用，會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。
細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意問(wèn)題
1.細(xì)胞培養(yǎng)液中一定要加HEPES，作用是穩(wěn)定液體的PH。HEPES的化學(xué)全稱位呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。
2.以培養(yǎng)基顏色的變化作為換液的指標(biāo)，是不夠，但很實(shí)用。因?yàn)榕囵B(yǎng)液中有指示劑酚紅存在，故液體顏色的變化可間接提示細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)。細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)酸，液體呈黃色；反之，液體會(huì)呈紫紅色。
3.在觀察細(xì)胞時(shí)，液體ph變化大，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。
4.是否所有的細(xì)胞培養(yǎng)基均適用同樣的CO2濃度？
其實(shí)不然，CO2濃度的選擇取決于NaHCO3濃度。CO2和溶液中的-HCO3形成緩沖體系，使得整個(gè)培養(yǎng)體系的pH值維持在弱堿性(7左右)，這也是哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的最適pH值。當(dāng)培養(yǎng)基長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中是，-HCO3會(huì)迅速分解，pH值快速升高，視覺(jué)觀感上即是從紅變紫。當(dāng)再次將培養(yǎng)基放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中后，在CO2的作用下，又會(huì)緩慢地從紫變回紅色。
不同的細(xì)胞培養(yǎng)基的NaHCO3濃度不一樣，使用不用的細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)選擇與之對(duì)應(yīng)的CO2濃度：
NaHCO3 (g/L) 濃度<1.5時(shí)，所需CO2濃度為4%；
NaHCO3 (g/L) 濃度處于1.5-2.2時(shí)，所需CO2濃度為5%；
NaHCO3 (g/L) 濃度處于2.2-3.4時(shí)，所需CO2濃度為7%；
NaHCO3 (g/L) >3.5時(shí)，所需CO2濃度為10%。
隨著細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，pH值逐漸不斷下降（由于乳酸的代謝性積累），培養(yǎng)基會(huì)變成黃色。當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液的pH發(fā)生不正常地變化時(shí)，我們需要這樣做：
1.確定是否使用不當(dāng)?shù)亩趸紳舛龋阂罁?jù)培養(yǎng)基中的碳酸氫鈉濃度來(lái)增加或降低培養(yǎng)箱中的二氧化碳百分比。對(duì)于2.0至3.7 g/L的碳酸氫鈉，分別使用5-10%的二氧化碳濃度?；驌Q用不依賴二氧化碳的培養(yǎng)基。
2.確定是否組織培養(yǎng)瓶蓋子過(guò)緊：將蓋子擰松1/4圈。
3.確定是否碳酸氫鹽緩沖不充分：加入HEPES緩沖液，使最終濃度達(dá)到10-25 mM。
4.確定是否培養(yǎng)基中含有錯(cuò)誤的鹽分：請(qǐng)?jiān)贑O2條件下使用Earle's鹽培養(yǎng)基，在大氣環(huán)境下使用Hanks'鹽培養(yǎng)基。
5.確定是否細(xì)菌，酵母或真菌污染：丟棄培養(yǎng)物及培養(yǎng)基，嘗試對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行去污染。
DMEM培養(yǎng)基常見(jiàn)問(wèn)題
為什么DMEM培養(yǎng)基是鮮紅色
培養(yǎng)基的顏色主要是酚紅來(lái)顯示的，酚紅指示顏色非常靈敏，p值范圍為6-8，顏色由黃變?yōu)樽霞t。酚紅不是必須的，在有些情況下甚至是多余的，酚紅有類似固醇類激素的作用，如果涉及到固醇類激素相關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)，最好不要添加。但是為了培養(yǎng)方便，能讓我們直觀地感覺(jué)培養(yǎng)液的狀況，加入酚紅后，如果培養(yǎng)液偏酸了，就顯示偏黃色，偏堿性了就顯示偏紫色。
為什么培養(yǎng)皿放在一個(gè)沒(méi)有開(kāi)啟CO2的孵箱里面，培養(yǎng)液顏色偏紫色
一般的DMEM使用的緩沖體系是NaHCO3， 初中的時(shí)候應(yīng)該見(jiàn)過(guò)如下的方程2NaHCO3=Na2CO3+CO2+H2O在沒(méi)有CO2的孵箱中，培養(yǎng)液中的CO2一直溢出，碳酸變少了，溶液變堿性了，就偏紫色了。同時(shí)我們打開(kāi)了很久的DMEM瓶里面的培養(yǎng)液也會(huì)慢慢偏紫色，也就是這個(gè)道理。
培養(yǎng)基偏紫色了還能用不
可以將該偏紫色的培養(yǎng)基置于CO2孵箱中，擰松瓶蓋。一段時(shí)間之后你會(huì)發(fā)現(xiàn)顏色變?yōu)轷r紅色了，那么可以繼續(xù)接著用。但是不要使用過(guò)長(zhǎng)時(shí)間未用完并且變色的培養(yǎng)液，置于空氣下氧化之后培養(yǎng)基成分可能已發(fā)生了變化。
在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，檢查培養(yǎng)液顏色與透明度的變化，顏色變黃，說(shuō)明PH值下降；變紅或紫紅色，說(shuō)明PH值上升，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、死亡，一般生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞2-3天換液一次，生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞可3-4天換液一次。
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