hPSCs細(xì)胞來源的腸類器官培養(yǎng)方案
發(fā)布時間：2023-07-21 瀏覽次數(shù)：653
腸上皮是成年哺乳動物中自我更新最快的組織，平均自我更新時間少于5天。腸干細(xì)胞位于腸隱窩（intestinal crypt）底部附近，每個隱窩中的干細(xì)胞大約有4-6個，它們產(chǎn)生快速增殖的轉(zhuǎn)運擴增(TA)細(xì)胞，腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞都從TA細(xì)胞發(fā)育而來。TA細(xì)胞快速分裂、轉(zhuǎn)運擴增的子細(xì)胞占據(jù)了隱窩的其余部分，并流向絨毛的側(cè)面，在那里它們分化、吸收營養(yǎng)，最終在絨毛尖端凋亡【1】。
在體外可以由hPSCs來模擬胚胎腸發(fā)育的過程，通過添加高濃度的FGF4和Wnt3A，促使hPSCs衍生的終內(nèi)胚層(DE)向中腸和后腸內(nèi)胚層分化，并促進(jìn)腸管樣形態(tài)發(fā)生，進(jìn)而產(chǎn)生包含吸收性腸細(xì)胞以及主要分泌譜系(包括Paneth細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞)的腸類器官。本篇文章基于Nature protocols【2】整理了hPSCs細(xì)胞來源的腸類器官培養(yǎng)方案。
細(xì)胞來源：hPSCs
培養(yǎng)基配方
hPSCs培養(yǎng)和傳代
1，將凍存的Matrigel在4°C下過夜解凍，在6孔板的每孔滴加1ml冷的Matrigel，旋動6孔板使Matrigel溶液分布均勻。隨后轉(zhuǎn)移至37℃條件下孵育10min使其凝固，使用前需室溫靜置1h。
2，將hPSCs接種在包被Matrigel的6孔板中，每孔加入3ml mTeSR1，放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約為75–85%、且大部分無分化的狀態(tài)時，吸出培養(yǎng)基。
3，向hPSCs中加入1 ml Dispase（1mg/ml），并將培養(yǎng)皿放置在37℃條件下進(jìn)行解離，直到所有的細(xì)胞都以小細(xì)胞塊或單細(xì)胞的形式漂浮。向每個孔中加入5ml的DMEM-F12，以充分稀釋Dispase。
4，將所有細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫下300g離心3min，收集沉淀細(xì)胞。加入DMEM-F12培養(yǎng)基，以1:6的比例接種在Matrigel包被的24孔培養(yǎng)板中，向每個孔中加入0.5ml預(yù)熱的mTeSR1進(jìn)行培養(yǎng)，在2-4天內(nèi)細(xì)胞匯合度達(dá)到85-90%。
hPSCs分化成DE
5，吸出mTeSR1，向每個孔中加入0.5 ml預(yù)熱的第1天內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，并將平板放回37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。
6，24h后，吸出第1天內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，替換為每孔0.5ml預(yù)熱的第2天內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，并將平板放回37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。
7，24h后，吸出第2天內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，替換為每孔0.5ml預(yù)熱的第3天內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，并將平板放回37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。
8，24h后，吸出第3天內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基，用不含Activin A的第3天內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。此時在顯微鏡下觀察細(xì)胞，應(yīng)該存在扁平的DE組織，該組織包含非常少的3D結(jié)構(gòu)。
DE分化為中腸和后腸
9，從24孔培養(yǎng)板中吸出培養(yǎng)基，每孔滴加0.5 ml預(yù)熱的中腸和后腸分化培養(yǎng)基。每24h更換一次新鮮中腸和后腸分化培養(yǎng)基，直至96h 。
10，在立體顯微鏡下，可以看到明顯的3D結(jié)構(gòu)。使用200μl移液器吸頭從每個孔中收集球狀體，并將大約50個球狀體集中到1.5ml微量離心管中。
中腸和后腸球狀體生長成人腸類器官
11，收集球狀體后，將微量離心管垂直放置在管架上10min，此時球體通過重力沉降到離心管底部。吸出上清，控制總體積在25μl左右。
12，將凍存的Matrigel在4℃下過夜解凍，添加B-27補充劑(終濃度1×)、R-spondin1(終濃度500ng/ml)，Noggin(終濃度100ng/ml)和EGF(終濃度100ng/ml)，用移液器吹打混勻，配制成腸基質(zhì)膠。
13，將球狀體滴加在預(yù)冷的腸基質(zhì)膠中，并將樣品混勻，總體積將達(dá)到75μl(50μl基質(zhì)膠+ 25μl培養(yǎng)基+球狀體)。
14，將混合物接種在4孔板中，注意需接種在孔的中心，避免接觸側(cè)壁。
15，將4孔板放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育10min，使Matrigel固化。
16，向每個孔中緩慢滴加0.5ml腸道生長培養(yǎng)基，確保基質(zhì)膠被完全覆蓋。
17，每隔4天，或當(dāng)培養(yǎng)基中的酚紅變黃時，更換腸生長培養(yǎng)基。
腸類器官傳代
18，在第14天左右，通過將腸類器官重新包埋在新鮮的Matrigel中，來實現(xiàn)傳代。
19，在顯微鏡下觀察類器官，吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入少量DMEM-F12培養(yǎng)基。
20，使用200μl移液器吸頭用力上下吹打Matrigel 3-5次，釋放Matrigel中的類器官。
21，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)組織14天，每4天更換一次腸道生長培養(yǎng)基。
圖1. 人腸類器官的培養(yǎng)過程【2】
腸類器官的最新應(yīng)用進(jìn)展
腸道類器官可以在體內(nèi)移植，作為再生醫(yī)學(xué)的臨床前工具。2022年2月日本學(xué)者Satoshi Watanabe等人【3】利用右旋糖酐硫酸鈉給藥，在結(jié)腸遠(yuǎn)端引發(fā)上皮損傷，隨后將腸道類器官原位移植到受體小鼠的結(jié)腸中，實現(xiàn)了上皮細(xì)胞的重建。這一步驟可在10分鐘內(nèi)完成，為腸類器官治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床試驗奠定了基礎(chǔ)。
圖2. 腸類器官（綠色）在移植1周后，成功整合到小鼠上皮損傷的區(qū)域【3】
類器官作為一種研究模型，在發(fā)育生物學(xué)、疾病病理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、再生機制、精準(zhǔn)醫(yī)療以及藥物毒性和藥效試驗等方面潛力巨大。但是，類器官培養(yǎng)技術(shù)建立過程中會面臨多種挑戰(zhàn)。
參考文獻(xiàn)
【1】SATO, Toshiro, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature, 2009, 459.7244: 262-265.
【2】MCCRACKEN, Kyle W., et al. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nature protocols, 2011, 6.12: 1920-1928.
【3】WATANABE, Satoshi, et al. Transplantation of intestinal organoids into a mouse model of colitis. Nature Protocols, 2022, 1-25.
來源：“近岸蛋白 ”公眾號，作者，Novoprotein。
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