食品及加工過程致病菌可混樣檢驗嗎？
發(fā)布時間：2023-08-16 瀏覽次數(shù)：425
來源：六扇門Study公眾號
對于重度/極重度危害的致病菌，如沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157：H7、單核細胞增生利斯特氏菌、嬰幼兒食品中克羅諾桿菌屬等致病菌一般為零容忍，采樣二級采樣方案，即m=0（不得檢出）。
對于這類“不得檢出”要求的致病菌通常采用先增菌的方式來提高致病菌檢出率，多數(shù)致病菌要求m=0 CFU/25g（mL），25g（mL）樣本加到對應(yīng)標準要求的225mL增菌液中進行增菌，之后再進行分離、鑒定等。
按照二級采樣方案一般n=5，也就是每批次要取5個樣品進行檢測，那是否可以并樣增菌檢測，或者先增菌然后混樣檢測呢？
致病菌混樣檢測是否有參考依據(jù)呢？
?ICMSF8中提到“如果方法已經(jīng)經(jīng)過驗證，可在增菌后檢測到單個細菌的生長，則可多個樣品（如5、10、15、20等）混樣進行一次檢驗?！?/span>
?ISO22964-2017克羅諾桿菌屬檢驗方法標準中也提出：針對10g檢測部分已經(jīng)進行了驗證，如果是大于10g（如混樣）需要進行驗證以確保檢測準確性。
?ISO6571-1-2017沙門氏菌檢驗方法標準中也提出：針對25g檢測部分已經(jīng)進行了驗證，如果是大于25g（如混樣）需要進行驗證以確保檢測準確性；大體積樣本（如BPW大于1L）推薦并樣前將BPW預(yù)溫到34-38°C。
?《生鮮農(nóng)產(chǎn)品行業(yè)李斯特菌環(huán)境監(jiān)測和控制指南》中也提出了環(huán)境采樣樣本混樣檢測的要求：
為了節(jié)省資金，采樣時會選擇合成2-5個樣本（例如，在多個表面使用相同的拭子/海綿）。
如果拭子是從一個區(qū)域合成的，如果出現(xiàn)陽性，處理措施一致，那么混合測試可能是合適的。
另一方面，混合檢測可能會稀釋目標生物的靈敏度。在大多數(shù)情況下，混合采樣不會提供關(guān)于哪個地點是陽性的信息，一旦混合樣檢出陽性，必須重新分開取樣測試。在許多這種情況下，這增加了重新采樣和重新測試的額外時間和成本。
今日話題：混樣檢測是否有被驗證過？
B. Jarvis在文獻《On the compositing of samples for qualitative microbiological testing》中驗證并闡述了混樣檢測需要考慮的實際因素。跟大家分享幾點內(nèi)容：
分享內(nèi)容1:
需要考慮檢測樣本中菌群的狀態(tài)，這是前提！
（1）測試樣品被目標菌和競爭菌群污染的初始水平;
（2）目標菌和競爭菌群的初始狀態(tài)(如亞致死損傷);
（3）在檢測條件下(時間、溫度、培養(yǎng)基中抑制劑的存在等)，目標菌和競爭菌群的生長趨勢。
分享內(nèi)容2:
增菌要求，1ml預(yù)增菌培養(yǎng)物中至少可被轉(zhuǎn)移1個目標菌
為了確保在1ml預(yù)增菌培養(yǎng)物中至少可被轉(zhuǎn)移1個目標菌，要求1ml培養(yǎng)物中至少平均存在7個活菌。類似的考慮也適用于將目標菌從增菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到分離瓊脂平板。如下表所示。
假設(shè)每25g樣品加入到225mL培養(yǎng)基中的樣品中有一個亞致死受損的目標致病菌，每ml培養(yǎng)物中至少平均出現(xiàn)7個活菌，250mL的增菌液中至少需要1750個活菌。這將需要至少11代（2048>1750）。根據(jù)培養(yǎng)溫度和競爭微生物可能產(chǎn)生的抑制作用，這可能需要增菌至少12小時以上(Jarvis 1989)。如果接種量較小(例如一個活菌在250 g合成樣品)，最小孵育時間可能超過12小時。
分享內(nèi)容3:
如果混樣檢測，方法體系如何選擇和驗證？
在選擇混樣檢測之前，有必要驗證每個食品大類的檢驗方法，以確保說明該方法的靈敏度足夠高，可以檢測到目標菌。
驗證要求必須確定該方法的靈敏度，理想情況下使用自然污染的食品基質(zhì)，以達到混樣檢測可能遇到的最低污染水平。
在實際檢驗中，這要求該方法足夠靈敏，可以檢測到食品基質(zhì)中最大混樣量（如250g或500g）的一個目標活菌。否則即使可以在25g中檢測到一個目標活菌，也不能確定該方法是否適用于混樣檢測，否則會造成結(jié)果假陰性。
以沙門氏菌檢測為例，
分析幾種混樣檢測的方法
假設(shè)某食品基質(zhì)檢測要求是每批次30個樣本，每個樣本取25g。為了降低工作量，有時建議將初始樣本單元混樣成少量的較大的測試樣本進行檢測。下面分析幾種混樣檢測方案。
方法1: 將30 x 25 g樣品單元(即750 g)混合成一個均勻混合的樣品，從中取一個25g進行檢驗分析。這種方法只測試一個具有代表性的25 g樣品單位，陰性結(jié)果沒有意義。—無效方法
方法2: 將30 x 25 g樣品單位隨機合成3組，以每組10 x 25 g樣品單位，將每個250 g復(fù)合樣品接種到2.25L的增菌液中， 培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)三種增菌液進行后續(xù)的培養(yǎng)和檢測程序。只要該方法能夠檢測250g產(chǎn)品中的1個活的沙門氏菌，且該方法已被驗證，該方法就是有效的，如果沒有驗證，也屬于無效方法。
方法3: 將30個樣本單獨進行增菌，增菌后將30個前增菌液中的1 ml（共30mL）轉(zhuǎn)移到選擇性增菌培養(yǎng)基中進一步增菌，然后進行接下來的檢測操作。且可以存儲原始的前增菌液，等待測試結(jié)果。
如果獲得了陽性結(jié)果，就可以回到原始的前增菌液中，通過進一步測試有多少個受污染的樣本存在來評估。這種方法的好處是，檢測30個樣本的概念沒有受到損害，因為混樣只是在增菌后進行的。—比較科學(xué)有效的方法
