如何實時、可多路共用監(jiān)測細胞培養(yǎng)基中代謝物？
發(fā)布時間：2024-10-21 瀏覽次數(shù)：261
對細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中特定代謝物濃度的高頻、實時測量將有助于更深入地了解細胞代謝，并促進在細胞培養(yǎng)方案中應(yīng)用良好的實驗室實踐標準。然而，目前可用的方法要么局限于單時間點和單參數(shù)測量，要么局限于可檢測分析物的范圍內(nèi)。基于電化學(xué)適配體生物傳感器（Electrochemical aptamer-based，EAB）在血液和組織體內(nèi)分析物的實時監(jiān)測中已經(jīng)應(yīng)用。在這里，作者描述了EAB傳感器的pH感知能力，它獨立于適配體序列的特定目標分析物。我們將這種雙重用途的EAB應(yīng)用于幾種體外細胞培養(yǎng)環(huán)境中pH和苯丙氨酸的連續(xù)測量。這種開發(fā)的微型EAB傳感器具有快速的響應(yīng)時間、良好的穩(wěn)定性、高重復(fù)性和生物學(xué)相關(guān)的靈敏度。作者還開發(fā)并表征了一種無泄漏的參比電極，它可以減輕從傳統(tǒng)參比電極中釋放出來的銀離子的潛在細胞毒性效應(yīng)。使用由此產(chǎn)生的雙用途傳感器，作者每小時對培養(yǎng)的上皮腫瘤細胞系（A549，MDA-MB-MB-23）和人成纖維細胞系（MRC-5）的培養(yǎng)基中的pH和苯丙氨酸濃度進行測量，持續(xù)時間長達72小時。這種可擴展技術(shù)可以被多路復(fù)用，用于pH和多種分析物的高通量監(jiān)測，以支持微生理系統(tǒng)的廣泛代謝分析。
圖1 圖文摘要
關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：
1、 EAB傳感器顯示了在峰值電壓中與pH值相關(guān)的線性位移
圖2 傳感器pH測量的特征
對工作緩沖液中的適配體傳感器的常規(guī)表征顯示，峰值電位隨pH值的變化而變化。色氨酸EAB傳感器和阿霉素EAB傳感器都顯示了線性的pH響應(yīng)曲線，這支持了pH傳感特性可能是使用亞甲基藍報告基因的EAB傳感器的一個通用特征的結(jié)論。
2、 與組織培養(yǎng)板兼容的傳感器
圖3 細胞培養(yǎng)條件下傳感器和無泄漏參比電極的表征
將EAB傳感器集成到多孔培養(yǎng)板中還需要考慮到物理破壞細胞融合層的可能性。作者將這三個電極集成到24孔板的一個單孔（直徑15.6mm）中，以提供更用戶友好和標準化的組裝，防止對細胞的損傷。用生物相容性的透明樹脂制備了一個3D打印的傳感器支架來固定三個電極。在中間打一個直徑1厘米的孔，以便插入3D打印傳感器支架。最后的培養(yǎng)板-傳感器組件防止傳感器和細胞單層之間的直接接觸，從而避免傳感器刮傷細胞層。
3、EAB傳感器在流動介質(zhì)中的性能及評估細胞代謝
圖4 傳感器系統(tǒng)中的細胞代謝測量
EAB傳感器在流動介質(zhì)中表現(xiàn)良好，確立了該傳感器在灌注系統(tǒng)中使用的潛力。因此，可以評估其在實時評估細胞代謝中的有效性。細胞培養(yǎng)中的實時原位測量在3小時的平衡期后開始，并每小時持續(xù)72小時。EAB傳感器的金電極每天被一個新鮮的金電極取代，每個功能化的金電極在浸入細胞培養(yǎng)基前進行校準。在MRC-5球狀體中評估了EAB的效用，其細胞數(shù)比懸浮在相同體積的墨爾本介質(zhì)中的A549單層高4倍。單層細胞培養(yǎng)pH在72 h時保持相對穩(wěn)定，球狀體在24 h時保持相對穩(wěn)定，這是在細胞培養(yǎng)開始和結(jié)束時進行的pH論文測量獨立證實的。相比之下，苯丙氨酸水平下降了，這反映了使用這種氨基酸來支持細胞代謝。與單層細胞相比，球狀體顯示出快速的苯丙氨酸清除率，而另一種單層培養(yǎng)的腫瘤細胞系MDA-MB-231（乳腺腫瘤）顯示出與A549細胞系相似的苯丙氨酸清除率。作者比較了傳感器衍生的苯丙氨酸測量與GC?質(zhì)譜質(zhì)譜分析。根據(jù)監(jiān)測第1天（初始）苯丙氨酸濃度與第4天（最終）苯丙氨酸濃度的比值，EAB測量的比值為0.42，GC?MS測量的比值為0.40。同樣，MRC-51天的MRC-5球狀體顯示低細胞毒性（乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性試驗，占上清中總LDH的61 6.3%），沒有明顯的形態(tài)學(xué)差異。因此，該傳感器在細胞培養(yǎng)中提供連續(xù)的pH和苯丙氨酸測量，具有穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，而沒有細胞毒性。
結(jié)論：作者開發(fā)了一種小型的兩用EAB傳感器系統(tǒng)，可以嵌入傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)板中進行實時研究。該傳感器可以在生理相關(guān)范圍內(nèi)同時測量pH和適配體-靶標苯丙氨酸，具有良好的精度和精度。該傳感器在靜態(tài)和流動培養(yǎng)基中功能良好。將無泄漏參考電極集成到我們的雙用途EAB傳感器系統(tǒng)中，提高了整個系統(tǒng)的穩(wěn)定性、滅菌性和生物相容性。然而，該系統(tǒng)目前面臨著與生物污染和長期穩(wěn)定性相關(guān)的挑戰(zhàn)，這必須在擴展應(yīng)用中得到解決。應(yīng)用瓊脂糖水凝膠涂層可以通過提供一個防止生物物質(zhì)積累的屏障來減輕生物污染。這種多路傳感器技術(shù)可以擴展到多重適配體雙用途EAB陣列，用于更全面地表征細胞培養(yǎng)中的培養(yǎng)基，包括芯片上的微生理系統(tǒng)和器官。
原文：Yang, Y., Gao, X., Widdicombe, B., Zhang, X., Zielinski, J. L., Cheng, T., Gunatilaka, A., Leung, K. K., Plaxco, K. W., Rajasekharan Unnithan, R., & Stewart, A. G. (2024). Dual-Purpose Aptamer-Based Sensors for Real-Time, Multiplexable Monitoring of Metabolites in Cell Culture Media. ACS nano, 18(38), 26127–26139. Advance online publication. https://doi.org/10.1021/acsnano.4c06813
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~陳諾。
