歐盟研究：實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)助力快速檢測飲用水中的大腸桿菌
在歐盟，飲用水的微生物質(zhì)量受到嚴(yán)格監(jiān)管，要求每100毫升水中腸道腸球菌和大腸桿菌的菌落形成單位不超過零個(gè)。傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的參考方法或最可能數(shù)（MPN）方法需要1-2天才能得出結(jié)果，這可能導(dǎo)致在污染事件發(fā)生時(shí)延誤及時(shí)采取行動(dòng)。相比之下，分子技術(shù)可以在幾小時(shí)內(nèi)提供結(jié)果。因此，開發(fā)和驗(yàn)證一種與參考方法一樣可靠的替代方法對(duì)于滿足歐盟飲用水指令（DWD）2020/2184的要求至關(guān)重要。
本研究的替代方法基于實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)，靶向大腸桿菌的16S rRNA基因。該方法由荷蘭和弗拉芒飲用水實(shí)驗(yàn)室開發(fā)并驗(yàn)證，JRC對(duì)其進(jìn)行了微調(diào)，使其在RNA提取過程中更具靈活性。研究分為兩個(gè)階段：第一階段的實(shí)驗(yàn)室間研究于2021年10月啟動(dòng)，涉及16個(gè)組織的18個(gè)實(shí)驗(yàn)室；第二階段的研究于2023年3月進(jìn)行，涉及17個(gè)組織的19個(gè)實(shí)驗(yàn)室。
圖1（不同污染水平下Ct值的分布）：展示了各參與實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同污染水平的水樣檢測結(jié)果，表明Ct值隨著污染水平的增加而逐漸降低，且大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室能夠有效區(qū)分陰性和陽性樣本。
在第二階段的研究中，JRC負(fù)責(zé)所有樣品的過濾工作，使用混合纖維素濾膜用于參考方法，而使用聚碳酸酯濾膜用于替代方法。樣品被分發(fā)給參與實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行RT-PCR分析。研究的主要目標(biāo)包括：驗(yàn)證分子方法在歐盟代表性規(guī)模上的適用性；測試改進(jìn)后的分子方法作為常規(guī)大腸桿菌檢測的替代方法；識(shí)別替代方法的關(guān)鍵組成部分以滿足與標(biāo)準(zhǔn)方法的等效性標(biāo)準(zhǔn)；并提出進(jìn)一步改進(jìn)的建議。
圖2（各參與實(shí)驗(yàn)室的Z分?jǐn)?shù)表現(xiàn)）：通過Z分?jǐn)?shù)評(píng)估各實(shí)驗(yàn)室在不同污染水平下的檢測結(jié)果，顯示大多數(shù)參與實(shí)驗(yàn)室的平均Z分?jǐn)?shù)在“很好”或“優(yōu)秀”范圍內(nèi)，證明了替代方法的可靠性。
經(jīng)過兩輪實(shí)驗(yàn)室間研究，替代方法顯示出略低于參考方法的敏感性（91.1% vs. 97.2%），但能夠更快地提供結(jié)果，使其成為一種有價(jià)值的篩查工具。在第二階段的研究中，替代方法的特異性為97.7%，敏感性為91.1%，相對(duì)檢測水平（RLOD）為1.790，表明參考方法的敏感性高于替代方法，但替代方法仍滿足方法比較研究的可接受性標(biāo)準(zhǔn)。
這項(xiàng)研究首次在歐盟范圍內(nèi)驗(yàn)證了實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)作為飲用水中大腸桿菌檢測的替代方法的可行性。該方法能夠在4-6小時(shí)內(nèi)完成檢測，相較于傳統(tǒng)的21-24小時(shí)，大大縮短了檢測時(shí)間。這對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)飲用水中的糞便污染、預(yù)防水傳播疾病和保護(hù)公共健康具有重要意義。
參考文獻(xiàn)：Gomez L, Brand?o J, Navarro A, et al. Application of a real-time reverse transcription polymerase chain reaction for rapid detection of Escherichia coli in drinking water: an EU representative study[J]. Environmental research, 2025: 121786.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~徐禮龍。
