圖文解說細胞傳代要點及注意事項
發(fā)布時間：2022-05-27 瀏覽次數(shù)：3497
傳代培養(yǎng)幾乎是所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養(yǎng)瓶中長到一定密度都會因為接觸抑制而停止生長，之后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細胞供實驗所需，但培養(yǎng)皿中的細胞很容易受到外界污染，培養(yǎng)液是營養(yǎng)富集的液體，可以支持細胞在其中生長，然而，水能載舟亦能覆舟，“好喝”的營養(yǎng)液，使得細菌們也能在培養(yǎng)液中快樂生長，同時離體培養(yǎng)的細胞也是各類病毒、支原體等的大愛，因此，需要周全保護細胞“寶寶”們，以下所有操作要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作。
細胞生長一般經(jīng)歷4個時期：潛伏期、對數(shù)生長期、平臺期和衰亡期【1】。其中對數(shù)生長期指細胞呈指數(shù)（2n）增長。處于對數(shù)生長期的細胞生長最快，細胞活力最強，是進行實驗的最佳時間。
細胞接觸抑制是正常細胞生長增殖的關鍵特性，被認為是調(diào)節(jié)細胞增殖的關鍵機制，這種機制可以有效地防止細胞增殖失控。在培養(yǎng)細胞時，正常細胞在高密度情況下發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象，使細胞周期停滯在G0/G1期，從而形成單層細胞【2】。因此我們在細胞發(fā)生接觸抑制前需要將細胞傳代來擴大細胞數(shù)量。
材料和器材
材料：培養(yǎng)瓶/皿，離心管，移液管，移液器，廢液缸，75%酒精，所需培養(yǎng)細胞。
藥品：DMEM培養(yǎng)基，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS緩沖液，青鏈霉素雙抗。
儀器：CO?培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈臺。
實驗步驟
細胞傳代圖解：
【預熱含10%血清的DMEM培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰酶】
Tips：作為熱源的金屬珠浴，要留意定期消毒哦~
【從培養(yǎng)箱拿出細胞，鏡下觀察細胞狀態(tài)，并判斷是否達到了可傳代的密度】
【回到超凈臺中，吸去培養(yǎng)基，加入PBS，晃一晃，潤洗一遍】
可重復以上動作，用PBS再次清洗，防止殘留培養(yǎng)液中的血清影響胰酶效果。
【吸去PBS，加入0.25%胰酶】
【放入37℃培養(yǎng)箱，開始消化并計時】
【1-2min后，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止，通過吹打使細胞脫離培養(yǎng)皿底部，最后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管】
【500 rpm細胞離心3min】
【棄上清，加DMEM培養(yǎng)基重懸】
【將細胞懸液加入培養(yǎng)皿中】
具體操作及tips：
無菌操作規(guī)范：在實驗開始前，需要將超凈臺紫外照射滅菌（至少20min），我們需要穿好滅菌服，戴好滅菌手套和口罩。
準備工作：將PBS，胰酶，含10%血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃下預熱。滅菌離心管，槍頭提前放入超凈臺照射紫外。
所有物品從外面移入超凈臺都需要噴灑75%酒精消毒，并且同樣用75%酒精消毒雙手。
① 從培養(yǎng)箱取出細胞培養(yǎng)皿（一般選擇處于對數(shù)期的細胞），倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和細胞密度，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。
② 用酒精噴壺在培養(yǎng)皿表面噴灑75%酒精消毒，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿到超凈臺，打開蓋子（注意酒精不要噴太多，打開蓋子也要小心，不要讓酒精誤進入皿內(nèi)），輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，加入適量PBS潤洗細胞1-2次（注意從側壁加入，以免沖掉細胞），棄去PBS緩沖液。
Tips：這一步的目的是要去除培養(yǎng)基中血清對胰酶消化細胞的影響喲~
③ 用移液器加入0.25%胰酶（Trypsin）于培養(yǎng)皿中（能夠鋪滿皿底即可，具體量根據(jù)實驗需要確定，過多或過少都不利實驗），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。
④ 將加入胰酶的細胞培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡載物臺，鏡下觀察細胞消化情況。對于貼壁牢的細胞，可用手指尖輕輕拍打培養(yǎng)皿底部，促使其脫落。待細胞大部分變圓并脫落，準備終止消化，加1-2倍體積的含10%血清培養(yǎng)基終止消化。
胰酶消化與血清終止原理小課堂：
細胞外含有多種胞外蛋白，如膠原蛋白以及糖蛋白，使細胞間或細胞與培養(yǎng)瓶內(nèi)壁粘連起來，而胰蛋白酶能夠催化蛋白質(zhì)的特定肽鍵（賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鍵）水解從而使得細胞從培養(yǎng)皿上脫落下來。而EDTA主要是通過螯合鈣鎂離子，鈣鎂離子是保持細胞間相互連接所必需的，所以沒有鈣鎂離子，貼壁細胞之間的連接就被打開了。
所以終止時我們所加的培養(yǎng)基中含有鈣鎂離子和胎牛血清，都是胰酶抑制劑，血清終止的原理其實是競爭抑制，就是用過量的血清含有的蛋白來和胰酶結合，從而不給胰酶消化細胞外蛋白的機會。
Tips：這一步要把握好時間，切勿消化過度，及時終止消化。如果消化不夠充分可以輕拍培養(yǎng)皿幫助細胞脫落，轉(zhuǎn)移進超凈臺也別忘了酒精消毒喲~
⑤ 用1ml移液槍輕輕吹打混勻，使細胞脫離培養(yǎng)皿底部，將混合細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中（離心管規(guī)格根據(jù)實驗需要確定），配平，500-800rpm離心3-5分鐘左右。
⑥ 離心好后，輕輕取出離心管。
Tips：此時可以看到細胞在管底形成肉眼可見的細胞團塊，團塊大小與細胞多少有關，拿取過程中小心不要發(fā)生碰撞，把管底的細胞團塊撞散，影響得率。
用酒精噴壺噴灑離心管表面，轉(zhuǎn)移進超凈臺，打開蓋子，將上清液小心倒入廢液缸，加入10%血清培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打，制成細胞懸液。這就是待接種的種子啦~
Tips：棄上清的動作需一次完成，切忌抬起管口，讓液體流回底部后，又再次傾倒?；亓鞯囊后w會把細胞團塊沖散甚至沖起來，再傾倒有把細胞團塊倒掉的風險。
⑦ 根據(jù)細胞生長特性，將細胞懸液按1：2-1：5的比例分到新的培養(yǎng)皿中，八字手勢晃勻后，置于倒置顯微鏡載物臺，觀察細胞情況。細胞喜歡扎堆，傳代接種應保證一定數(shù)量，數(shù)量太少“胞二代”們會長不起來喲。
Tips：原代脂肪細胞可以少批次的傳代，因其較永生化細胞更脆弱，傳代密度適當提高，更有利于其生長哦。
⑧ 在培養(yǎng)皿上做標記，注明傳代時間，細胞種類，操作人員等信息。在放入培養(yǎng)箱之前應再次用酒精噴一噴培養(yǎng)皿表面，放入培養(yǎng)箱后，把培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞再次晃動使其鋪板均勻，防止生長密度不一，最后關上培養(yǎng)箱的門。
⑨ 傳代完成啦，記得整理操作臺，用75%酒精擦拭超凈臺臺面，清理廢液和垃圾，最后打開超凈臺內(nèi)的紫外燈。
⑩ 在細胞傳代前如果培養(yǎng)基有變黃跡象，吸去培養(yǎng)基，加入新鮮的含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。
Tips：培養(yǎng)基的紅色是酚紅試劑的顏色，酚紅試劑是一種pH指示劑，中性時為紅色，堿性時為紫色，酸性時為黃色。細胞生長繁殖會消耗培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)，分泌代謝產(chǎn)物，如果細胞生長旺盛，代謝活躍，產(chǎn)生大量乳酸和CO?。在細胞培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)液由紅變黃說明營養(yǎng)物質(zhì)消耗掉了，該換培養(yǎng)基了，此時也可以查看一下細胞密度，是否就需要傳代啦~另外如果有支原體污染，也會使培養(yǎng)基發(fā)黃，但細胞會在幾周后死亡。因此大家需要每天check好細胞狀態(tài)喲~
參考文獻：
【1】Eagle H et al. Nature. 1967.
【2】Abercrombie M et al. Nature. 1979
