常見的細(xì)胞培養(yǎng)問題
發(fā)布時間：2022-06-13 瀏覽次數(shù)：2039
1. 解凍后觀察:
| 1-1 鏡檢(Microscopic) | 可能引起的原因 | 解決方式 |
1-1-1 細(xì) 胞 數(shù) 少 | 1. 解凍后若以離心方式去除DMSO，部分細(xì)胞未有效沉淀，細(xì)胞數(shù)將會減少。
2. 有些細(xì)胞容易絮聚而沈積在冷凍管底部，若吸取細(xì)胞懸浮液前沒有充分混合均勻，則可能只吸到細(xì)胞數(shù)較少的上清液。 | 1. 考慮直接將解凍后的細(xì)胞懸浮液加入含新鮮培養(yǎng)基中直接培養(yǎng)，細(xì)胞貼附后，第二天再更換培養(yǎng)基。 2. 細(xì)胞解凍后 pipetting 5 至 7次，混合均勻。 |
1-1-2 存 活 率 不 佳 | 1-1-2-1 有些細(xì)胞本身冷凍后存活率不佳或細(xì)胞數(shù)較少。 | 解凍后先培養(yǎng)在 T25 flask。 |
1-1-2-2 解凍后受 DMSO 毒害: 1. 細(xì)胞對 DMSO 的毒性較為敏感，例如:HL-60 細(xì)胞。 2. 細(xì)胞解凍后，細(xì)胞懸浮液在冷凍管內(nèi)時間拖太久。
3. 解凍后的細(xì)胞懸浮液種至(seeding) 含新鮮培養(yǎng)基的flask 內(nèi)，但由于培養(yǎng)基量太少而不足以稀釋 DMSO 的毒性。 | 1. 解凍后的細(xì)胞必須立刻經(jīng)由離心方式去除 DMSO。 2. 先將所有實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備齊全，培養(yǎng)基預(yù)熱好再進(jìn)行解凍。 3. 至少加入 10ml 以上的新鮮培養(yǎng)基或使 DMSO 濃度在 1 %以下。 | |
1-1-2-3 解凍前后受溫度變化之傷害: 1. 收到本所寄出的細(xì)胞后沒有馬上解凍培養(yǎng)或是暫存在-80℃冰箱的時間太久。
2. 從液氮筒將冷凍管取出至解凍這段期間沒有以干冰或液氮攜帶。 3. 以瞬間加溫使冷凍管內(nèi)的冰塊外圍融解，并將細(xì)胞冰塊取出加至新鮮培養(yǎng)基的方式解凍。（未待冷凍細(xì)胞完全溶解即操作）。 4. 有些細(xì)胞須培養(yǎng)于 28℃，培養(yǎng)基亦必須預(yù)熱至 28℃，但若以 37℃操作則會使細(xì)胞凍后存活不佳。 | 1. 收到細(xì)胞后最好是盡速解凍培養(yǎng)或暫存于-80℃冰箱，并于翌日轉(zhuǎn)移到液氮筒內(nèi)。若暫存于 -80℃冰箱時，時間不宜太久，以 1-2 天為宜。 2. 以干冰或液氮暫存筒移送。
3. 將冷凍細(xì)胞迅速完全解凍后，經(jīng)酒精擦拭冷凍管后，立刻移入無菌操作臺操作。
4. 以 28℃快速解凍。培養(yǎng)基亦預(yù)熱于 28℃水浴槽，而非 37℃，如一般魚類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、蚊子細(xì)胞等。 | |
1-1-2-4 滲透壓傷害(Osmotic damage) 1. 冷凍后的細(xì)胞懸浮液直接快速加入培養(yǎng)基中。
2. 解凍后的細(xì)胞懸浮液加入PBS 以稀釋 DMSO 的毒性。 | 1. 將培養(yǎng)基以一滴一滴加入的方式加至細(xì)胞懸浮液中。若是直接 seeding 至 flask 中，除了上述的做法外，可將已裝有培養(yǎng)基的 flask 傾斜，然后加入細(xì)胞懸浮液使其沿著瓶壁慢慢滑入培養(yǎng)基中。 2. 改用培養(yǎng)基稀釋。 | |
1-1-2-5 沒有依照本所所建議使用的培養(yǎng)基。 | 冷凍細(xì)胞的活化，請絕對依照建議使用的培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長良好且已保存一批冷凍備份細(xì)胞后，再進(jìn)行其他培養(yǎng)基之置換工作。 |
2. 解凍后數(shù)日及繼代培養(yǎng)后觀察: (參考文獻(xiàn) 1 和 2)
| 2-1 巨觀(Macroscopic) 依培養(yǎng)基顏色判斷 | 可能引起的原因 | 解決方式 |
| 2-1-1 呈黃色混濁 | 污染。很可能是細(xì)菌或酵母菌污染。 | 丟棄已污染的細(xì)胞。 |
2-1-2 黃 色 澄 清 | 1. 細(xì)胞已長滿或過度長滿。 2. 培養(yǎng)基太酸，但并不是因?yàn)榧?xì)胞代謝所導(dǎo)致的，而是因?yàn)榕囵B(yǎng)箱中過高濃度CO2 造成。 3. 霉?jié){菌污染。 | 1. 立刻繼代培養(yǎng)。 2. 根據(jù)細(xì)胞的需求給予適當(dāng)濃度的 CO2，并檢查培養(yǎng)箱之 CO2 濃度是否正確。
3. 進(jìn)行霉?jié){菌檢測，若為positive，丟棄之。 |
2-1-3 明 亮 紫 紅 色 | 培養(yǎng)基太鹼 1. 最有可能是培養(yǎng)箱中過低濃度的 CO2 所造成。 2. 瓶蓋鎖太緊或未松開。
| 1. 檢查 CO2 供應(yīng)是否正常。
2. 將蓋子稍微旋松。 |
2-1-4 類 似 綿 花 狀 的 漂 浮 物 | 可能是真菌污染。這類的污染在早期并不會使得培養(yǎng)基變黃。但在顯微鏡下可觀察到菌絲體。 | 丟棄已污染的細(xì)胞。另外，必須檢視培養(yǎng)箱內(nèi)有無這類真菌的污染，因?yàn)槲廴镜募?xì)胞培養(yǎng)基溢出時可能會促進(jìn)該類真菌的生長。 |
2-2 鏡檢(Microscopic) | 可能引起的原因 | 解決方式 |
2-2-1 細(xì) 胞 生 長 狀 態(tài) 不 佳 (附注 a) | 1. 霉?jié){菌污染。
2. 細(xì)菌所引起的慢性、較低程度的感染。 3. 培養(yǎng)基成分改變。有些細(xì)胞對此種改變特別敏感，例如更換新的血清; 使用過期的 glutamine 及其它添加成分、較差的水質(zhì)、或是少加了某些添加物 ( 例 如nonessential amino acid)。 4. 貼附性細(xì)胞繼代培養(yǎng)時過度地 trypsinized，或是稀釋比例(split ratio)過高。
| 1. 做污染檢測，若有霉?jié){菌污染則丟棄。 2. 污染檢測。
3. 培養(yǎng)基及其它添加物使用前必須更特別注意。
4. Tryspin 作用時應(yīng)以倒立顯微鏡觀察細(xì)胞脫落的情形，并適時終止 trypsin 作用。使用 trypsin時應(yīng)注意其保存期限及使用的次數(shù)，避免 trypsin 失活。 |
2-2-2 一串串珠狀物 | 酵母菌生長而成之成串的珠狀物。大約比細(xì)胞小 5~10 倍。 | 直接丟棄。 |
2-2-3 生 長 太 慢 | 通常是霉?jié){菌所引起，但仍有許多其它的可能性會導(dǎo)致生長過慢： 1. 培養(yǎng)基過期或是沒有適當(dāng)?shù)馁A存。 2. Glutamine 貯存時間太長。 3. 血清-更換使用其它批號或品牌的血清或是血清種類使用錯誤，又或者是濃度配制錯誤。 4. 培養(yǎng)箱的溫度或是二氧化碳的濃度不對。 5. 培養(yǎng)器材和培養(yǎng)基成分應(yīng)選用細(xì)胞培養(yǎng)用的等級。 6. 處理細(xì)胞之程序不佳，例如 trypsin 作用時間過長；細(xì)胞長太滿才繼代培養(yǎng)；或是繼代培養(yǎng)的稀釋比例太高。 | |
2-2-5 特 性 改 變 | 1. 培養(yǎng)基不正確(但細(xì)胞仍可生長)。 2. 長期繼代，自然篩選結(jié)果。 3. 培養(yǎng)基不正確(但細(xì)胞仍可生長)。 4. 長期繼代，自然篩選結(jié)果。 | 建議停止繼續(xù)使用，除非對此種特性改變，有研究之價值，另當(dāng)別論。 |
附注 a:細(xì)胞生長狀態(tài)不佳可能產(chǎn)生的現(xiàn)象:
懸浮細(xì)胞會以半貼附、暗沈、生長不良、粗糙不平整、細(xì)胞周圍含有囊泡并含有大量的細(xì)胞碎片。貼附性細(xì)胞除了上述特征外，細(xì)胞容易脫離底部。
參考文獻(xiàn):
1. Darling, D.C. and Morgan, S.J. (1994) Animal cells culture and media.Wiley. John Wiley& Sons. Inc., publication.
2. Freshney, R.I.(2000) Culture of animal cells.4th ed. Wiley-Liss. John Wiley& Sons. Inc., publication.
