GB 4789.2-2022標(biāo)準(zhǔn)變更初探

菌落總數(shù)測(cè)定是食品微生物檢驗(yàn)中應(yīng)用得最為廣泛一個(gè)檢測(cè)方法，其國標(biāo)方法文本屢經(jīng)修訂，不斷完善。歷經(jīng)了1984版、1994版、2003版、2008版、2010版、2016版到今天的2022版，在38年間已經(jīng)陸續(xù)修訂發(fā)布了7個(gè)版本，平均5年修訂一次，這應(yīng)該是GB4789系列里之最了，恐怕在國家標(biāo)準(zhǔn)中也不多見，足見其重要性。

即將實(shí)施——：
      《GB 4789.2-2022 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》于2022年6月30日發(fā)布，將于2022年12月30日起正式實(shí)施。在這半年的新舊版過渡期內(nèi)，廣大食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)組織技術(shù)人員深入學(xué)習(xí)和理解新舊標(biāo)準(zhǔn)文本的差異，并進(jìn)行必要技術(shù)性驗(yàn)證。以下就是筆者對(duì)新版標(biāo)準(zhǔn)文本變更的一些粗淺認(rèn)識(shí)，希望達(dá)到拋磚引玉的效果。

作為一個(gè)應(yīng)用廣泛、檢測(cè)頻次較高的方法標(biāo)準(zhǔn)，其細(xì)微的變化都會(huì)引起業(yè)界的關(guān)注，尤其是某些重大的變化甚至還可能會(huì)帶來一系列的連鎖效應(yīng)?？偟膩碚f，新版標(biāo)準(zhǔn)再次引入了測(cè)試紙片法，這應(yīng)該是一個(gè)突破，預(yù)示著今后國標(biāo)方法體系對(duì)于傳統(tǒng)方法的可能會(huì)有更多的補(bǔ)充，此外還增加了菌落計(jì)數(shù)范例，完善了一些文字方面的細(xì)節(jié)，進(jìn)一步增強(qiáng)了方法標(biāo)準(zhǔn)的可操作性、實(shí)用性、靈活性。

設(shè)備材料

將3.3中原來的“恒溫水浴箱”修改為“恒溫裝置”，擴(kuò)大了適用范圍，便于實(shí)驗(yàn)室靈活采用各種適宜的保溫方式，并將溫度范圍由“46℃±1℃”改為“48℃±2℃”，以呼應(yīng)后文中設(shè)備和溫度范圍的變化。在實(shí)際應(yīng)用中，很多實(shí)驗(yàn)室在恒溫水浴箱之外可能還采用了專用的培養(yǎng)基液化保溫裝置等設(shè)備，新標(biāo)準(zhǔn)修訂之后賦予了這些補(bǔ)充手段的合規(guī)性。無論采用怎樣的等效手段，實(shí)驗(yàn)室一定要重視保溫裝置的溫度校準(zhǔn)和日常監(jiān)控、維護(hù)保養(yǎng)。

培養(yǎng)基和試劑

（一）增加了“4.2菌落總數(shù)測(cè)試紙片：應(yīng)符合GB4789.28中平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基質(zhì)量控制要求，且主要營養(yǎng)成分與平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基配方一致”。

      1、相較于傳統(tǒng)的平板傾注法，測(cè)試紙片法具有易用、便捷、高效、不具熱損害的優(yōu)點(diǎn)，測(cè)試紙片法首次出現(xiàn)在2008版并作為第二法，但僅在兩年后即在2010版中被刪除。而類似的《SN/T 1897-2007 食品中菌落總數(shù)的測(cè)定 Petrifilm?測(cè)試片法》比2008版更早發(fā)布實(shí)施，但也已于2015年被廢止，給出的理由是“方法涉及試劑盒，未經(jīng)評(píng)估”。[1]目前涉及紙片法的現(xiàn)行有效的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 4544.1-2016 商品化試劑盒檢測(cè)方法 菌落總數(shù) 方法一》以及即將實(shí)施的《SN/T 4544.2-2022 商品化試劑盒檢測(cè)方法 菌落總數(shù) 方法二》，明確了測(cè)試紙片的商品化試劑盒性質(zhì)。然而，這次修訂的文本并未將測(cè)試紙片法作為第二法來呈現(xiàn)，可能也還是出于審慎的態(tài)度。

      2、測(cè)試紙片“主要營養(yǎng)成分與平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基配方一致”即指符合附錄A.1的PCA主要成分，包括：胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖，至于其他成分如顯色劑、冷凝膠等各品牌配方可能會(huì)有差異。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)要求廠家提供配方證明文件，并作比較確認(rèn)。

      3、至于測(cè)試片的技術(shù)性驗(yàn)收，如果參照現(xiàn)行的GB 4789.28可能不具可操作性，因?yàn)樾枰M(jìn)行劃線測(cè)定生長率，鑒于測(cè)試紙片的物理性狀可能不太適合，只能等待新版的GB 4789.28正式發(fā)布。目前可供參考的是《SN/T 4544.1-2016 商品化試劑盒檢測(cè)方法 菌落總數(shù) 方法一》和《SN/T 4544.2-2022 商品化試劑盒檢測(cè)方法 菌落總數(shù) 方法二》附錄中的評(píng)價(jià)方法。該附錄參照《SN/T 2775-2011 商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》要求，評(píng)價(jià)了特定品牌測(cè)試紙片與國標(biāo)法的線性關(guān)系及準(zhǔn)確度、耐變性、批間差異，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證試驗(yàn)。程序比較復(fù)雜，工作量較大，對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)室可能較難完成。

（二）將老版的“生理鹽水”和“磷酸鹽緩沖液”均加上了“無菌”作為定語修飾，與后文6.1中的描述呼應(yīng)，也進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了無菌操作。

（三）測(cè)試紙片的相關(guān)知識(shí)[2]

      1、檢測(cè)原理：測(cè)試片主要由培養(yǎng)基、冷水可凝膠、顯色劑組成，菌落總數(shù)大多數(shù)用的顯色劑是TTC。細(xì)菌在測(cè)試片上生長時(shí)，細(xì)胞代謝產(chǎn)物與濃度極低的指示劑TTC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將指示劑還原成紅色產(chǎn)物，從而使細(xì)菌著色。所以，大多數(shù)測(cè)試片上紅色菌落判斷為菌落總數(shù)。

      2、適用范圍：由于操作簡(jiǎn)單，被廣泛使用于加工過程菌落總數(shù)快速測(cè)定。適用于大部分食品及環(huán)境涂抹樣本，適用范圍較廣泛。

      3、常見品牌：目前市場(chǎng)上的主流測(cè)試片形式有測(cè)試片和測(cè)試板，測(cè)試片又分冷水可溶性凝膠的和無紡布兩種，測(cè)試板多為板上加無紡布的形式。常見的進(jìn)口品牌包括美國3M、美國Charm、日本DNP、德國默克等，國產(chǎn)品牌有陸橋、環(huán)凱、美正等。

      4、常見的問題
      ① 出現(xiàn)菌落蔓延、水化現(xiàn)象。冰淇淋、糕點(diǎn)、加工肉制品、調(diào)味料等食品中的芽孢桿菌易發(fā)生液化現(xiàn)象，可以通過減少堆疊數(shù)量或者進(jìn)一步稀釋來解決。
      ② TTC作為指示劑是否會(huì)抑制菌落的生長？測(cè)試片添加的極低濃度TTC不足以對(duì)多數(shù)常見微生物造成抑制，此外多數(shù)測(cè)試片的工藝采取的是分層涂布，TTC位于最上層，因此只有當(dāng)菌落凸出之后才能接觸到低濃度TTC。
      ③ 顏色較深的樣品可能會(huì)有干擾，部分辛辣調(diào)味料會(huì)有干擾抑制，可選擇合適的稀釋倍數(shù)或帶濾網(wǎng)的均質(zhì)袋進(jìn)行樣品處理，具體依據(jù)各廠家的技術(shù)聲明來執(zhí)行。
      ④ 開封后測(cè)試片保存方式。密封夾密封后，常溫/冷藏、避光、干燥保存，并于1個(gè)月內(nèi)使用完。如果從冰箱中取出后要常溫放置一段時(shí)間再打開使用以防止冷凝水的產(chǎn)生。

檢驗(yàn)程序

主要是對(duì)“圖1 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序”增加了一些注釋性文字：
      1、將“2個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度”改為“1個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度”，與后文“6.1.5”的改動(dòng)保持一致。
      2、“培養(yǎng)”框之下的箭頭旁增加“36℃±1℃，48h±2h”和“水產(chǎn)品30℃±1℃，72h±3h”的文字描述。

操作步驟

（一）樣品的稀釋

      1、6.1.1和6.1.2中提及的“生理鹽水”和“磷酸鹽緩沖液”均增加了“無菌”作為修飾定語。

      2、6.1.2 中增加了“或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min”明確了液體樣品允許使用均質(zhì)器進(jìn)行均質(zhì)，這是符合現(xiàn)實(shí)需要的改變。此外，還增加了“如果結(jié)果單位為g的時(shí)候按6.11取樣方式前處理”的描述，解決了冰塊、冰淇淋等固體樣本融化后取樣方式的困擾。

      3、6.1.3 中將“振搖試管或用1支無菌移液管反復(fù)吹打使其混合均勻”改為“在振蕩器上振蕩混勻”。

      4、6.1.5中將“2~3個(gè)適宜稀釋度”改為“1~3個(gè)適宜稀釋度”，更加靈活，切合實(shí)際情況。允許只做1個(gè)梯度，減少了檢測(cè)的工作量，但對(duì)檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和操作水平要求更高了，如果僅有的一個(gè)梯度出現(xiàn)多不可計(jì)或平行不好的情況則難以保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性，此外如果出現(xiàn)樣本中抑菌物質(zhì)造成的計(jì)數(shù)結(jié)果與稀釋度不成比例現(xiàn)象，也不容易發(fā)現(xiàn)，因此建議盡量采用2~3個(gè)稀釋度以規(guī)避可能的風(fēng)險(xiǎn)。

      5、從此處開始，文中所有的“平皿”均替換為“培養(yǎng)皿”，更加規(guī)范和準(zhǔn)確，但其他同時(shí)期發(fā)布的新標(biāo)準(zhǔn)中并未執(zhí)行這一術(shù)語的統(tǒng)一。

      6、6.1.6中的平板計(jì)數(shù)瓊脂溫度由“46℃”改為“46℃~50℃”，相應(yīng)地，括弧內(nèi)恒溫水浴鍋及其溫度均改為“恒溫裝置”和“48℃±2℃”。美國FDA BAM規(guī)定為45℃±1℃，ISO 4833-1：2013為44℃~47℃（將改為47℃~50℃）。在實(shí)際工作中，尤其是冬季氣溫較低的時(shí)候，考慮到傾注的時(shí)間，適當(dāng)提高瓊脂的溫度使得更具可操作性。然而過高的溫度可能會(huì)對(duì)某些細(xì)菌造成損傷，影響結(jié)果，因此實(shí)驗(yàn)室務(wù)必把握好尺度。

（二）培養(yǎng)

      1、6.2.1這里的仍然沿用的“平板”而非之前的“培養(yǎng)皿”，是筆誤還是修訂者認(rèn)為傾注了培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿才能叫做平板呢？并且在段首的“待瓊脂凝固后”之前加了“水平放置”作為狀語進(jìn)行修飾，強(qiáng)調(diào)了操作細(xì)節(jié)。

      2、原來的6.2.2合并到了6.2.1的段末。

      3、原6.2.2改為：“如果使用菌落總數(shù)測(cè)試片，應(yīng)按照測(cè)試片所提供的相關(guān)技術(shù)規(guī)程操作”。這里所謂的技術(shù)規(guī)程，應(yīng)該就是指的其使用說明書，市場(chǎng)上的測(cè)試紙片品牌較多，種類也較多，具體操作細(xì)節(jié)可能存在一定的差異性，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書，建立作業(yè)指導(dǎo)書，對(duì)操作人員進(jìn)行培訓(xùn)和考核。

      4、水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度和時(shí)間仍然保持不變，但在工作實(shí)踐中，檢驗(yàn)員往往會(huì)對(duì)“水產(chǎn)品”指代的范圍產(chǎn)生困惑，新版標(biāo)準(zhǔn)能夠給與一個(gè)明確的定義和舉例就更好了。

（三）菌落計(jì)數(shù)

      6.3.2中刪掉了段末的“每個(gè)稀釋度的菌落總數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)”，應(yīng)該是避免與后面7.1.2中的公式應(yīng)用產(chǎn)生歧義。

結(jié)果與報(bào)告

（一）菌落總數(shù)的計(jì)算方法：詳細(xì)規(guī)定了6種情形的菌落計(jì)算方法，并且還在附錄B中逐一提供了相應(yīng)的案例，便于讀者理解。

（二）菌落總數(shù)的報(bào)告：刪掉了老版的“7.2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延”，這是因?yàn)榍拔?.3.2已經(jīng)明確要選擇“無蔓延菌落生長”的平板，故實(shí)際上已經(jīng)明確蔓延菌落為不適合計(jì)數(shù)的情況，所以這句話是多余的。

主要參考文獻(xiàn)

[1]國家認(rèn)監(jiān)委辦公室關(guān)于公布2015年檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)復(fù)審結(jié)論的通知
[2]微信公眾號(hào)：六扇門study——GB4789.2修訂一大亮點(diǎn)：增加測(cè)試片方法的并行準(zhǔn)入

文章來源：網(wǎng)友Milonese原創(chuàng)分享，環(huán)凱小編轉(zhuǎn)載于食品微生物檢測(cè)公眾號(hào)！  
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