大腸菌群能力驗證不會做？聽資深檢測人員按流程講解心得體會
發(fā)布時間：2023-07-04 瀏覽次數(shù)：2142
來源：“食品微生物檢測”公眾號 作者：岳正華
原標(biāo)題：大腸菌群能力驗證不會做？聽資深檢測人員按流程講解心得體會
前不久，參加了中檢院“乳粉中大腸菌群的檢測能力驗證”心情有點小緊張，此次大腸菌群以定量的方式進行考核，樣品為2個，西林瓶真空包裝，呈白色凍干塊狀，每個樣等同于60.0mL的待測乳品樣品。
大腸能力驗證實驗
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收到樣品后，確認(rèn)樣品包裝是否完好，并將其保存在2~8℃冰箱中，然后在能力驗證平臺進行確認(rèn)。
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方法選擇和人員比對的探討：
根據(jù)能力驗證參試指導(dǎo)書確定測試方法，樣品為待測乳品，乳品判定標(biāo)準(zhǔn)常采用平板法，首選GB4789.3-2016中第二法《大腸菌群平板計數(shù)法》。樣品稀釋梯度到10-4，第一法《大腸菌群MPN計數(shù)法》作為方法比對，樣品稀釋梯度到10-6；與此同時，選擇快速紙片法做參考，紙片選取來自美國和日本兩個廠家的大腸菌群測試片進行測定。
人員比對為兩人，分別選取市面上兩家不同廠家(如環(huán)凱生物)的培養(yǎng)基進行測試比對。
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進行實驗，將樣品從冰箱中取出達到室溫后開啟使用，在生物安全柜下先用5mL稀釋液（選取的生理鹽水）進行水化后吸入無菌瓶或袋中，再用剩余的55mL稀釋液進行洗滌并轉(zhuǎn)入無菌瓶或袋中。
洗滌轉(zhuǎn)移時注意樣品瓶蓋的清洗和無菌操作，將60mL的樣品進行均質(zhì)混勻，原液立刻進行接種；再取25mL到225mL稀釋液中均質(zhì)混勻，制成10-1梯度樣品勻液，乳液中含有蛋白質(zhì)具有發(fā)泡性，均質(zhì)時易產(chǎn)生較多氣泡，會影響體積，導(dǎo)致結(jié)果偏低，為減少誤差可從原液中取25mL到225mL稀釋液中手動混勻，混勻時注意觀察產(chǎn)生氣泡的多少。
用1mL無菌吸管取1:10的樣液到9mL生理鹽水試管中，制成1:100的樣液，以此類推。再將幾個稀釋度的樣液接種到無菌平皿和LST肉湯中。從樣品的制備到接種全程應(yīng)不超過15分鐘，然后在36℃中培養(yǎng)，平板和紙片24h，LST肉湯發(fā)酵管24~48h。
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在培養(yǎng)18h時觀察發(fā)酵管產(chǎn)氣情況，紙片和平板的菌落生長情況并進行初步計數(shù)，待時間到時進行具體的菌落計數(shù)，在菌落數(shù)為15-150之間的平板上選取可疑的紫紅色較小菌落5個如圖（一）中黃圈標(biāo)注；選取紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)的較大典型菌落5個，如圖（一）中紅圈標(biāo)注；選取可疑紫紅色似有破痕的菌落5個，如圖（一）中藍(lán)圈標(biāo)注，進行驗證。對LST肉湯發(fā)酵管中產(chǎn)氣管進行復(fù)發(fā)酵證實實驗。為求準(zhǔn)確挑取圖一的下一個梯度平板上的所有菌落作確認(rèn)，如圖（二）。
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觀察可疑菌落在BGLB中產(chǎn)氣情況，如下圖（三），圖中菌落形態(tài)小的產(chǎn)氣量最大，菌落形態(tài)大的反而產(chǎn)氣量最小，說明產(chǎn)氣量多少不以其形態(tài)的大小來衡量，而是以菌含量的高低判斷。
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結(jié)果的計算和對比:
對上述結(jié)果分析可知采用兩個不同廠家的培養(yǎng)基進行平板法和MPN法測試，檢驗結(jié)果未見顯著差異。采用紙片法，不論是國外廠家還是國內(nèi)廣東環(huán)凱廠家的大腸菌群測試片在低濃度時，檢測結(jié)果與國標(biāo)法差異不大，但是隨著樣品濃度的增加，檢測結(jié)果相對國標(biāo)法有較大的差異。其中紙片作為一種快速測試方法，其優(yōu)越性也顯而易見，操作簡單，判讀明確，縮短檢測時間，可作為一種快速篩選的方法。
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在對結(jié)果進行分析后，選取平板法的檢測結(jié)果的平均值進行網(wǎng)絡(luò)提交。
最后，收到中期報告，兩個樣的Z值分別為+0.1和-0.3，在偏差±2.0范圍內(nèi)結(jié)果滿意。
望此次試驗經(jīng)歷和心得能夠給與做微生物的小伙伴們一點小小借鑒，同時也希望同行給與更多的建議。
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