多重PCR技術革新：快速鑒定大腸桿菌的三基因方案
發(fā)布時間：2024-10-08 瀏覽次數(shù)：311
大腸桿菌是一種性質極其多樣的物種，成為一種模式生物，用于研究細菌的結構、代謝和行為，并廣泛用于實驗室中的遺傳改造研究。它進化適應了人類腸道，既作為共生種，也作為致病種。目前我們對為何該物種表現(xiàn)出致病性和非致病性行為的理解仍然有限。研究表明，這可能是由于三種情況之一：獲得新基因、抗毒力基因的失活，或基因功能發(fā)生變化的點突變。由于基因組與菌株表型之間的復雜關系，很難制定出單一的分類系統(tǒng)。系統(tǒng)發(fā)育上的歸類與表型之間沒有明確的聯(lián)系，分類體系的區(qū)分能力差，且臨床菌株范圍廣泛。
隨著新的體外分析數(shù)據的快速涌入，研究人員經常面臨兩個問題：當前方法需要頻繁重新評估，并且設計新的、可靠的診斷工具極其困難。迄今為止，已經提出了許多診斷測試方法，包括生化測試、血清分型、噬菌體引發(fā)的溶解實驗，或不同變種的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）方法。
目前，已經開發(fā)了多種PCR檢測大腸桿菌的方法。最常見的分子靶標包括在大多數(shù)大腸桿菌菌株中存在的編碼酶的基因。兩種通常用于PCR檢測的基因是β-D-半乳糖苷酶（lacZ）和β-D-葡萄糖醛酸酶（uidA）。利用uidA基因可以用于分類那些缺乏酶活性但仍然具有基因序列的大腸桿菌。然而，研究表明，uidA和lacZ基因并不特異于大腸桿菌。此外，區(qū)分侵襲性大腸桿菌（Escherichia coli, EIEC）和與其密切相關的志賀氏菌也很困難，因為這兩種細菌在生化和血清學上構成了獨特的大腸桿菌病原變種。通常通過引物靶向lacY（乳糖通透酶）基因來區(qū)分這兩個屬，但研究表明該基因并不唯一特異于大腸桿菌。
近日，波蘭羅茲Proteon Pharmaceuticals公司生物信息學和遺傳學部Jaros?aw Dastych團隊在Microbiology Spectrum期刊上發(fā)表了題為：Novel multiplex-PCR test for Escherichia coli detectiony論文。
為了解決該問題，本研究提出使用cydA（細胞色素bd復合物的一部分）、lacY（編碼乳糖通透酶的基因）和ydiV（調節(jié)細菌運動的基因）這三個基因為多重PCR的靶點。通過這三個基因的組合，可以生成指定大小的三個擴增子，表明受試菌株屬于大腸桿菌物種。
在該研究中，研究人員決定靶向三個基因：cydA（編碼細胞色素bd-I泛醌氧化酶亞基1的基因）、lacY（編碼乳糖通透酶的基因）、ydiV（基因產物參與群體感應和運動調節(jié)）。為了準備引物，從NCBI數(shù)據庫中獲取了這些基因的序列，這些序列來自1171個完整的大腸桿菌基因組。使用MAFFT進行多重序列比對，選擇保守片段，并基于這些片段構建了用于新型多重PCR測試的引物。
然后，我們在一個由47370個不同腸桿菌科基因組組成的大型數(shù)據集上使用體外PCR（in silico PCR, isPCR）對這些引物進行了測試。結果顯示，在19802個大腸桿菌數(shù)據集中，我們檢測到了18963株大腸桿菌，靈敏度為95.76%。在27568個非大腸桿菌基因組中，有27427株未被檢測到，特異性為99.49%。整體準確度達到了97.93%。該新方法顯示出很高的分辨能力，能夠有效區(qū)分大腸桿菌和非大腸桿菌。特別值得注意的是，與其他診斷方法相比，該方法在區(qū)分大腸桿菌和志賀氏菌方面表現(xiàn)出色。
在相同的數(shù)據集上使用其他研究人員提出的條件進行了isPCR，并根據敏感性、特異性和準確性將這些方法與本研究提出的多重PCR進行了比較。
本研究開發(fā)的多重PCR顯示出與之前發(fā)表的檢測方法相當，甚至略高的準確性（97.93%）。將志賀氏菌與大腸桿菌區(qū)分開仍然是一個診斷難題。我們的方法對志賀氏菌屬的特異性為95.93%，高于其他方法。
圖1 散點圖，其中x軸表示靈敏度/召回率（檢測到的大腸桿菌的比例），而y軸表示特異性（正確檢測的比例）。點越靠近右上角，準確度越高。這些參數(shù)是根據對腸桿菌科數(shù)據集執(zhí)行的isPCR計算得出的。點填充的顏色表示測試的檢測方法，與框中的圖例相對應。點越靠近右上角，準確度越高。
圖2 顯示了不同大腸桿菌檢測方法的預測準確度的條形圖。
下一步是對設計的多重PCR進行實驗室條件下的驗證。為此，提取了20株大腸桿菌和20株非大腸桿菌菌株的基因組DNA。為了檢查獲得真陽性結果的可能性，使用了20株大腸桿菌菌株的基因組材料。所有測試的樣本均成功擴增了用于鑒定大腸桿菌所需的三個基因（如圖3所示），獲得真陽性結果的概率為100%。
圖3 cydA、lacY、ydiV基因在細菌菌株基因組DNA上多重擴增后的PCR產物（2%瓊脂糖凝膠電泳）。NTC—無模板對照，PC—陽性對照。M—marker；圖左側以bp為單位顯示分子大小標記的大小。
為了檢查獲得真陰性結果的可能性，使用了20株非大腸桿菌的腸桿菌目菌株的基因組DNA。測試的所有樣本均未顯示出三個基因的擴增，因此未獲得假陽性結果，真陰性結果的概率為100%。
為了確定對特定樣本進行技術復現(xiàn)的結果總和與測試樣本數(shù)量之比，使用了10株被鑒定為大腸桿菌的菌株和10株被鑒定為非大腸桿菌的菌株。每個菌株進行了10次技術重復，成功復現(xiàn)真陽性或真陰性結果的概率為100%。
圖4 cydA、lacY、ydiV基因在細菌基因組DNA上多重擴增后的PCR產物（2%瓊脂糖凝膠電泳）。NTC—無模板對照，PC—陽性對照。M—marker；圖左側以bp為單位顯示分子大小標記的大小。
為了評估正確診斷結果所需的最小DNA量，使用了八種不同濃度的大腸桿菌基因組DNA（每次反應加入110-0 ng的DNA）。凝膠電泳結果如圖5所示，除了0 ng（無模板對照——NTC）之外，每個濃度下均獲得了三個基因的擴增產物，足以做出正確的診斷。
圖5 cydA、lacY、ydiV基因在大腸桿菌不同量基因組DNA上多重擴增后的PCR產物（2%瓊脂糖凝膠電泳）。NTC—無模板對照，PC—陽性對照。M—標記物；圖左側以bp為單位顯示分子大小標記物的大小。
PCR測試用于細菌混合物時，可能會從三個不同的細菌基因組中檢測到每個擴增子之一，從而導致假陽性信號。這種局限性通常出現(xiàn)在其他多基因檢測方法中，而單基因檢測方法則沒有這個問題。盡管單基因檢測方法可能較為方便，使用靶向多個基因（cydA、lacY和ydiV）的引物對可以確保在按程序執(zhí)行的情況下減少假陽性檢測的可能性，且每個檢測到的擴增子還提供了代謝相關的信息。綜上所述，該測試可用于快速、可靠地識別大腸桿菌，例如用于疑似敗血癥、新生兒腦脊液感染和腦膜炎等的臨床診斷中。
論文來源：https://doi.org/10.1128/spectrum.03773-23
來源：微生物安全與健康網，作者~段子璇。
