致瀉大腸埃希氏菌生物學(xué)特性

致瀉大腸埃希氏菌：一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的大腸埃希氏菌,可經(jīng)過污染食物引起人類發(fā)病。
大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性短小桿菌，分類學(xué)上屬于腸桿菌科大腸埃希氏菌屬。
常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌EPEC、腸道侵襲性大腸埃希氏菌EIEC、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌ETEC、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌STEC(包括腸道出血性大腸埃希氏菌EHEC)和腸道集聚性大腸埃希氏菌EAEC。

致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)程序

操作注意事項(xiàng)
      1：對(duì)易產(chǎn)生較大顆粒的樣品（如肉類）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，建議使用帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋，以便均質(zhì)后用吸管吸取勻液；
      2：取前增菌液接種腸道菌增菌肉湯后需在42±1 ℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，該溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)有助于抑制非腸道菌生長；
      3：分離劃線用直徑3mm的接種環(huán)（1環(huán)約10微升）；
      4：可疑菌落的選取，應(yīng)是每個(gè)瓊脂平板上分別取10~20個(gè)（10個(gè)以下的全選）乳糖發(fā)酵和不發(fā)酵的菌落；
      5：在TSI培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)將試管口松開，保持管內(nèi)有充足的氧氣，否則由于氧氣不足，斜面酸性產(chǎn)物不能氧化恢復(fù)紅色。
      6：大腸埃希氏菌H抗原在傳代中容易丟失或發(fā)育不良，需在半固體上傳代3次，觀察生長，如不擴(kuò)散，則表示H抗原丟失，無法做H抗原凝集試驗(yàn)。

培養(yǎng)基原理解析

營養(yǎng)肉湯：
胨和牛肉浸出粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源，氯化鈉能維持均衡的滲透壓，有利于損傷細(xì)菌的復(fù)蘇。

腸道菌增菌肉湯：
蛋白胨提供蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸;葡萄糖提供碳源；酸氫二鈉和磷酸二氫鉀為緩沖劑；牛膽鹽和煌綠為選擇性抑菌劑，抑制非腸桿菌科細(xì)菌的生長。

麥康凱瓊脂（MAC）：
該培養(yǎng)基中含有牛膽鹽和結(jié)晶紫，可抑制革蘭氏陽性菌的生長，細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時(shí)菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現(xiàn)膽鹽沉淀的渾濁圈。
分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色，培養(yǎng)基周圍有膽鹽沉淀環(huán)；不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色。

伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）：
乳糖作為可發(fā)酵碳源，伊紅和美藍(lán)同時(shí)作為抑菌劑和指示劑，在酸性條件下，兩者結(jié)合形成黑色沉淀并可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅和美藍(lán)比例相關(guān)。
分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤；不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色。

三糖鐵瓊脂：
該培養(yǎng)基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例為10:10:1，只能利用葡萄糖的細(xì)菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸使斜面先變黃，但因量少，生產(chǎn)的少量酸。因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌生長利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故斜面后來又變紅。底部由于厭氧狀態(tài)，酸類不被氧化，仍保持黃色。而發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，則產(chǎn)生大量的酸，使整個(gè)培養(yǎng)基呈黃色。另外，因某些細(xì)菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)生成黑色的硫化亞鐵沉淀。

氰化鉀利用試驗(yàn)
氰化鉀是細(xì)菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細(xì)菌的生長,但有的細(xì)菌在一定濃度的氰化鉀存在時(shí)仍能生長,以此鑒別細(xì)菌。
結(jié)果判讀：陽性為試驗(yàn)管和對(duì)照管都有生長變渾濁； 陰性為試驗(yàn)管澄清不見生長，對(duì)照管生長渾濁。

靛基質(zhì)試驗(yàn)
某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。
結(jié)果判讀：陽性為滴加靛基質(zhì)試劑后液面立即變玫紅色；  陰性為滴加試劑后不變紅色。

尿素酶試驗(yàn)
具有尿素酶的細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的尿素，產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)呈堿性，酚紅指示劑在pH6.8時(shí)呈黃色，pH8.1呈粉紅色。
結(jié)果判讀：陽性為玫紅色；  陰性為淡橙紅色-淡黃色。

生化試驗(yàn)結(jié)果判讀 - 大腸埃希氏菌的生化特征

取生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落進(jìn)行PCR確認(rèn)試驗(yàn)

PCR確認(rèn)試驗(yàn) - 致泄大腸埃希氏菌特征基因

PCR試劑盒檢測(cè)流程

致瀉大腸埃希氏菌多重PCR試劑盒特點(diǎn)

致瀉大腸埃希氏菌多重PCR試劑盒，各試劑盒檢測(cè)的對(duì)應(yīng)特征性基因如下：

血清學(xué)試驗(yàn)（選做項(xiàng)目）

取PCR試驗(yàn)確認(rèn)為致瀉大腸埃希氏菌的菌株進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。

O抗原鑒定
1）檢查培養(yǎng)物有無自凝性：在潔凈玻片上滴一滴生理鹽水，用接種環(huán)蘸少許待測(cè)培養(yǎng)物，混合于生理鹽水內(nèi)，1分鐘內(nèi)無凝集現(xiàn)象，為無自凝，反之，有自凝性。
2）假定性試驗(yàn)：先用大腸埃希氏菌O多價(jià)血清做玻片凝集，如果多價(jià)有凝集現(xiàn)象，再用多價(jià)所包含的單價(jià)O血清做試驗(yàn)，如與某一單價(jià)O血清有凝集反應(yīng)，即為假定性試驗(yàn)陽性，反之為陰性。
3）確證試驗(yàn)：測(cè)試培養(yǎng)物制成3號(hào)麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，與假定陽性的O單價(jià)血清（原效價(jià)1:160~1:320，0.5%鹽水稀釋至1:40）等量混合，放50±1 ℃，培養(yǎng)16h，觀察結(jié)果，如凝集，可證實(shí)為該O抗原。

H抗原鑒定
先穿刺半固體，有動(dòng)力再做H抗原鑒定。

質(zhì)量控制及疑難解析

質(zhì)量控制
      1： 為了控制環(huán)境污染，每次檢驗(yàn)過程中，于檢驗(yàn)臺(tái)上打開兩塊計(jì)數(shù)瓊脂平板，并在檢驗(yàn)環(huán)境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，以掌握檢驗(yàn)過程中是否存在來自檢驗(yàn)環(huán)境的污染。
       2： 定期使用致瀉大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或相應(yīng)定量活菌參考品，在P2實(shí)驗(yàn)室或陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M(jìn)行陽性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，染菌量應(yīng)控制在10~100CFU/25g，并進(jìn)行記錄，次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)至少每2個(gè)月進(jìn)行1次。
       3：可以使用全自動(dòng)或半自動(dòng)的核酸提取儀提取DNA，但必須經(jīng)過驗(yàn)證后使用。
       4：每次PCR應(yīng)使用EPEC EIEC ETEC STEC/EHEC EAEC標(biāo)準(zhǔn)菌作為陽性對(duì)照。同時(shí)使用大腸埃希氏菌ATCC25922或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對(duì)照，以滅菌去離子水作為空白對(duì)照，控制PCR污染體系。

疑難解析

Q1：僅用毒力基因檢測(cè)就能對(duì)致瀉大腸埃希氏菌進(jìn)行確認(rèn)嗎？
      按照GB4789.6-2016要求，需要先對(duì)可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，生化鑒定為大腸埃希氏菌后，再進(jìn)行毒力基因的檢測(cè)，判定是何種致瀉大腸埃希氏菌。因?yàn)樵谀c桿菌科中，一些致病也存在相同的毒力基因，所以不能對(duì)可疑菌落直接進(jìn)行毒力基因檢測(cè)來判定何種致瀉大腸埃希氏菌。

Q2：如何看待血清型與PCR結(jié)果不符的情況？
      確實(shí)有這情況存在，由于血清型判定依據(jù)是菌體抗原（O抗原、H抗原、K抗原），這些抗原并不是致瀉大腸埃希氏菌發(fā)病的根本原因，而且相同血清型致瀉大腸埃希氏菌中，存在不同致病型的大腸埃希氏菌，也就是說不同致瀉大腸埃希氏菌“共享”同一個(gè)血清型，這是血清鑒定致瀉大腸埃希氏菌的不足之處，另外，隨著人類對(duì)致瀉大腸埃希氏菌致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并找到引起不同致病型的特征性毒力基因，因此，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)以PCR為確認(rèn)方法，而血清學(xué)診斷只是選做項(xiàng)目。

所需培養(yǎng)基試劑