黃曲霉毒素具有較強的毒害作用,可誘發(fā)肝、腎、肺、胃等部位的癌變,黃曲霉毒素B1被公認為是目前致癌力最強的天然物質。
藥材、飲片及制劑在貯藏、制備、運輸過程中,如保存不當,就會有受潮霉變而污染黃曲霉毒素的可能。
因此,各藥典都將黃曲霉毒素列為很重要的安全性指標,中國藥典和歐洲藥典對多種中藥材都都建立了黃曲霉素檢查指標,美國藥典對植源性的藥品也要求檢查黃曲霉毒素。
今天小編就詳細介紹中國藥典、歐洲藥典和美國藥典的黃曲霉毒素測定方法,總結出各藥典的差異,并列出詳細的檢驗方法,供各位參考。
1、比較中國藥典、美國藥典、歐洲藥典的檢查方法
各藥典中方法號、限度、適用范圍等列表如下,由此可見,各藥典收載的檢測方法不同、限度不同,最嚴格的當屬歐洲藥典。
對比內容 | 中國藥典 | 美國藥典 | 歐洲藥典 | |
---|---|---|---|---|
依據 | 通則2351真菌毒素測定法 | GENERAL CHAPTERS<561> | 2.8.18 DETERMINATION OF AFLATOXIN B1 IN HERBAL DRUGS | |
方法 | 第 一 法 | HPLC法 | TLC法 | HPLC法 |
第 二 法 | HPLC-MS法 | 薄層掃描法 | ||
第 三 法 | 酶聯免疫法 | HPLC法 | ||
限度 | 每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg ,總量不得過 10μg。 | 每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg,總量不得過 20μg。 | 每1000g含黃曲霉毒素B1不得過2μg,總量不得過4μg。 | |
說明 | 中國藥典的三種方法都可以使用,當測定結果超出限度時,采用第二法進行確認。 | 首先使用第一法,第一法系統(tǒng)適用性不通過才會使用第二法或第三法。 | 只有一種方法,適用于devil' s claw root, ginger and senna pods,用于其他品種需要驗證適用性。 |
注:總量為黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)的總量。
2、詳解中國藥典、美國藥典、歐洲藥典的HPLC方法
黃曲霉毒素檢查方法中,唯一同時適用于三家藥典的方法,只有HPLC法(熒光檢測器),而且光化學檢測器與HPLC-熒光檢測器配套使用,在線對黃曲霉毒素B1、G1進行衍生,不需要任何化學試劑,應用范圍較廣,因此本文重點比較此法在各藥典中的異同。
從以下幾部分可以看出,色譜柱、流動相、流速、波長、供試品和對照品的配制方法、進樣量等內容都存在較大差異,需要謹慎對照使用。
本文詳細寫出了USP中的幾種測定方法。
2.1 中國藥典中黃曲霉毒素檢查方法(HPLC法)
檢驗方法 | 具體內容 |
---|---|
色譜柱 | 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑 |
流動相 | 甲醇-乙腈-水(40 : 18 : 42) |
流速 | 1.0mL/min |
柱后衍生化 | 光化學衍生器(254nm) |
檢測器 | 熒光檢測器,激發(fā)波長360nm (或365nm),發(fā)射波長450nm。 |
系統(tǒng)適用性 | 兩個相鄰色譜峰的分離度應大于1.5;需確認回收率應在60~120%,線性回歸的相關系數應不低于0.990; |
混合對照品溶液 | 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 標示濃度分別為 1.0μ/mL、0. 3μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL)0.5mL,置10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1mL,置25mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,即得。 |
供試品溶液 | 取供試品粉末約15g(過二號篩),精密稱定,置于均質瓶中,加入氯化鈉3g,精密加入70%甲醇溶液75mL, 高速攪拌2 分鐘(攪拌速度大于11000 r/min),離心 5 分鐘(離心速度4000r/min),精密量取上清液15mL, 置50mL量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,離心 10分鐘(離心速度4000r/min),精密量取上清液20mL,通過免疫親合柱,流速每分鐘3mL, 用水20mL洗脫(必要時可以先用淋洗緩沖液10mL洗脫,再用水10mLl洗脫),棄去洗脫液,使空氣進人柱子,將水擠出柱子,再用適量甲醇洗脫, 收集洗脫液,置 2mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0. 22μm)濾過,取續(xù)濾液,即得。 |
進樣量 | 混合對照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl;供試品溶液20~50μl。 |
定量方法 | 測定各對照品溶液的峰面積,以峰面積為縱坐標,以進樣量為橫坐標,繪制標準曲線;測定供試品溶液的峰面積,從標準曲線上讀出供試品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量,并計算出四者總和。 |
2.2 美國藥典中黃曲霉毒素檢查方法(HPLC法)
檢驗方法 | 具體內容 |
---|---|
色譜柱 | 4.6-mm×15 cm,3-μm填料L1(即十八烷基硅烷鍵合硅膠) |
流動相 | 水-甲醇-乙腈(60:25:15) |
流速 | 0.8 mL/min |
柱后衍生化 | 光化學衍生器(254nm) |
檢測器 | 熒光檢測器,激發(fā)波長362nm,發(fā)射波長440nm |
系統(tǒng)適用性 | 洗脫順序為AFG2、AFG1、AFB2和AFB1; 將5號線性對照溶液5mL加入到5g的樣品中,按“供試品溶液”(甲醇-0.5%碳酸氫鈉(7:3)用量為20mL)處理方法,計算AFB1(2μg/kg)和黃曲霉毒素(5μg/kg)的平均回收率,應分別不低于68%和70%。AFB1和黃曲霉毒素總量的相對標準偏差(RSD)不高于10%。 |
免疫親和柱預處理 | 免疫黃曲霉素柱的總黃曲霉毒素最小容量不低于100ng。將AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每個5ng,溶于10mL 10%甲醇的磷酸鹽緩沖鹽溶液(v/v)中時,各回收率不低于80%。 |
對照品溶液 | 用乙腈制備AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別含有2.0、0.50、2.0和0.50μg/mL的混合對照溶液。首先用乙腈制備標示濃度均為10μg/mL的各儲備液,在360nm附近測定最大吸光度,計算公式為:黃曲霉毒素濃度(μg/mL)=(A×Mr×1000)/ε,其中A為吸光度,Mr為分子量,ε為摩爾吸收系數,見附表1。準確量取一定量黃曲霉毒素各儲備液至同一容量瓶,用乙腈稀釋至規(guī)定濃度。冰箱儲存,使用前平衡至室溫。用甲醇 - 水(1:1)稀釋黃曲霉素對照溶液,最終濃度見附表2。冰箱保存,使用前平衡至室溫,每日新制。 |
供試品溶液 | 取樣品5g,置于50mL離心管中,加入氯化鈉1 g和甲醇 - 0.5%碳酸氫鈉(7:3)25 mL。在渦流混合器上混合,直到樣品顆粒和提取溶劑充分混合,400 rpm振搖10min,7000 rpm離心10min,立即取7 mL至50 mL離心管中,加入0.1 M磷酸鹽緩沖溶液28 mL,混合,過濾,收集25mL濾液(相當于1g樣品)到25mL刻度量筒中,并立即上IAC柱。[注:對于IAC柱在使用前必須在室溫下至少平衡15分鐘。]從小柱上取下頂蓋,并將其與儲液罐連接。從柱上拆下端蓋,并將其連接到柱歧管上(必須擰緊)。讓柱中的液體通過,直到液體高出柱床約2~3 mm。將濾液25mL倒入儲液罐。讓液體自然流過柱子,讓柱子流干。為了便于再次開始流動,從歧管上取下色譜柱,向柱中加入磷酸鹽緩沖鹽溶液約2 mL,將色譜柱重新連接到儲液罐上,然后用磷酸鹽緩沖鹽溶液3mL和水5mL清洗色譜柱(如果使用其他技術去除柱末端的氣泡并很容易重新開始流動,則可將磷酸鹽緩沖鹽溶液5mL直接加入到柱儲液罐中)。讓柱子流干,然后用注射器注入3mL空氣通過柱子,用甲醇1mL洗脫,并用3mL容量瓶中收集洗脫液,使洗脫液自由滴落。讓柱子流干。靜置1分鐘,然后用額外的甲醇1mL洗脫,并收集在同一容量瓶中。讓柱子流干,并注入10mL空氣通過柱子,用水稀釋洗脫液至刻度,立即進行分析。 |
進樣量 | 50μl |
定量方法 | 毒素(μg/kg)={[(R?a)/S]×V/W}×F R=樣品溶液的峰面積;a=校準曲線的y截距;S=校準曲線的斜率;V=樣品溶液的最終體積(mL);W=通過免疫柱的供試品1g;F=稀釋系數,V=3 mL時為1;黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。 |
2.3 歐洲藥典中黃曲霉毒素檢查方法(HPLC法)
檢驗方法 | 具體內容 |
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色譜柱 | 柱長0.25m,直徑4.6mm,十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相(5-μm) |
流動相 | 乙腈-甲醇-水(2:3:6) |
流速 | 1.0mL/min |
柱后衍生化 | 光化學衍生器(254nm) |
檢測器 | 熒光檢測器檢測,激發(fā)波長= 365nm,發(fā)射波長Aem =435nm。 |
系統(tǒng)適用性 | 出峰順序:G2、G1、B2、B1;需滿足驗證要求。 |
對照品溶液 | 用甲苯-乙腈(98:2)制備10μg/mL AFB1貯備溶液,并在330nm~370nm波長范圍內測定吸收曲線,計算公式為:黃曲霉毒素濃度(μg/mL)=(A×M×100)/ε,其中A為紫外吸收曲線上的最大吸光度,M為B1的分子量(312g/mol),ε為摩爾吸收系數(1930m2/mol)。用甲苯-乙腈(98:2)將初級貯備液稀釋為100ng/mL的次級貯備液,用鋁箔緊密包好后,置于4℃儲存,使用前,待溶液恢復至室溫后才能取下鋁箔。使用前后記錄容量瓶的重量。按附表3制備系列對照溶液,將所需體積的次級貯備液置于250mL容量瓶中,氮氣吹干,加入甲醇75mL溶解黃曲霉毒素B1,并用水稀釋至刻度。 |
免疫親和柱預處理 | 免疫親和柱對黃曲霉毒素B1的容量不低于100 ng。將AFB1 5 ng,溶于12.5mL甲醇和87.5 mL 水中時,回收率不低于80%。使用前平衡至室溫。 |
供試品溶液 | 取本品粉末5.00g,加入甲醇:水(70:30)混合溶液100mL,超聲處理30min,取濾液10mL至150mL錐形瓶,并加入水70mL。取40mL以流速3mL/min(不得超過5mL/min)通過免疫親和柱。用水以流速5mL/min沖洗小柱兩次,每次10mL. 用注射器注入空氣10s。取甲醇5mL注入小柱,并保持自然流出,收集洗脫液至5mL容量瓶中,1min后,注入甲醇0.5mL ,再隔1min后,注入甲醇0.5mL,每次加入甲醇后,均通過注入空氣收集洗脫液,用水稀釋至容量瓶刻度,搖勻。溶液澄清的話,可直接用于分析;否則應過濾處理,并確保黃曲霉毒素沒有損失。 |
進樣量 | 500μl |
定量方法 | 用黃曲霉毒素B1系列對照溶液1~5做標準曲線,樣品濃度超出線性范圍,則需要做相應稀釋。 毒素(μg/kg)=[(R?b)/a]×V /W R=樣品溶液的峰面積;b=校準曲線的截距;a=校準曲線的斜率;V稀釋倍數;W=通過免疫柱的供試品g;黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。 |
2.4 上述方法中的三個附表
附表1 | |||
---|---|---|---|
黃曲霉毒素 | M | 溶劑 | ε |
AFB1 | 312 | 乙腈 | 20700 |
AFB2 | 314 | 乙腈 | 22500 |
AFG1 | 328 | 乙腈 | 17600 |
AFG2 | 33 | 乙腈 | 18900 |
附表2 | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|
序號 | 黃曲霉素對照溶液加入量(μl) | 黃曲霉素工作對照溶液(ng/ml) | ||||
AFB1 | AFB2 | AFG1 | AFG2 | 總和 | ||
1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
2 | 12.5 | 0.25 | 0.0625 | 0.25 | 0.0625 | 0.625 |
3 | 25 | 0.5 | 0.125 | 0.5 | 0.125 | 1.25 |
4 | 50 | 1 | 0.25 | 1 | 0.25 | 2.5 |
5 | 100 | 2 | 0.5 | 2 | 0.5 | 5 |
6 | 200 | 4 | 1 | 4 | 1 | 10 |
附表3 | ||
---|---|---|
系列對照溶液 | 加入次級貯備液的體積(μl) | 對照溶液的最終濃度(ng/ml) |
1 | 125 | 0.05 |
2 | 250 | 0.1 |
3 | 500 | 0.2 |
4 | 750 | 0.3 |
5 | 1000 | 0.4 |
3、注意事項
由于黃曲霉毒素的毒性,實驗過程必須小心謹慎,小編總結出4條注意事項,供大家參考:
1、使用真菌毒素對照品,必須穿好防護服,帶好手套,在通風櫥內進行,并將工作臺蓋上膠布。非實驗人員未經允許,不得進入實驗室,以免發(fā)生意外。
2、黃曲霉毒素容易光降解,實驗過程需要避光,對照品和供試品溶液也需要避光保存,線性對照溶液需要臨用現配。
3、真菌毒素為痕量分析,易受環(huán)境污染,應隨行進行空白試驗與加樣回收率實驗。
4、用過的玻璃儀器需用次氯酸鈉溶液浸泡2小時。
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