一、 稱(chēng)樣：

(1) 一般稱(chēng)量25g，由于稱(chēng)樣量較大，標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于稱(chēng)樣的準(zhǔn)確性未作出明確規(guī)定，微生物室常用稱(chēng)樣的電子天平最大允許誤差為±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原則，即實(shí)際稱(chēng)樣時(shí)可根據(jù)樣品情況稱(chēng)取超出25g (如硬質(zhì)糖果等，檢驗(yàn)人員應(yīng)依據(jù)樣品實(shí)際情況決定如何稱(chēng)樣) ;

(2) 對(duì)于部分食品添加劑已明確須稱(chēng)取1.0g的，則須嚴(yán)格精確稱(chēng)量。

二、 樣品稀釋?zhuān)?/span>

(1) 固體或半固體：稱(chēng)取25g樣品于均質(zhì)袋中，加入已滅菌的生理鹽水225g，稍捏碎（特別是糕點(diǎn)/面包及其他淀粉制品），放入拍擊式均質(zhì)器均質(zhì) 1min，此時(shí)即制備成 1：10 的樣品勻液。以滅菌移液器吸取該液體至 9mL 滅菌生理鹽水試管中，換上新的滅菌移液器槍頭，緩緩吸取液體后反復(fù)吹打 2次，此時(shí)即制備成 1:100 的勻液，以此類(lèi)推，制備10倍系列稀釋勻液。

(2) 液體樣品：直接吸取原液進(jìn)行檢驗(yàn)，稀釋時(shí)可直接吸取1mL原液到9mL滅菌生理鹽水試管中按照“固體或半固體”的方式稀釋。

三、稀釋度的選取：液體樣品可直接取原液進(jìn)行檢驗(yàn)；固體或半固體則必須依據(jù)檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，選取2-3個(gè)適宜稀釋度進(jìn)行檢驗(yàn)(一般樣品選取1: 10, 1: 100， 1: 1000三個(gè)稀釋度進(jìn)行檢驗(yàn)。若遇到不常做的樣品，可適當(dāng)延長(zhǎng)稀釋度至1: 100000 甚至1: 1000000)。

四、質(zhì)量控制：空白對(duì)照：分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對(duì)照。（若空白有菌落生長(zhǎng)則該實(shí)驗(yàn)無(wú)效）。

五、平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)：滅菌條件為121℃、15min。一般情況下于500mL敞口錐形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。

 六、有時(shí)樣品基質(zhì)比較特殊，樣品勻液有細(xì)小的顆粒與菌落不易區(qū)分，此時(shí)可采用如下方法進(jìn)行區(qū)分：

   （1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又稱(chēng)紅四唑或紅四氮唑，簡(jiǎn)稱(chēng)TTC），高壓滅菌后避光冷藏備用。紅四唑滅菌條件為：121℃、20min；

   （2）待PCA瓊脂培養(yǎng)基冷卻至適宜傾注溫度時(shí)，無(wú)菌加入上述TTC溶液2mL，充分搖勻（此時(shí)PCA中TTC濃度為0.005%）。

 加入TTC的目的及注意事項(xiàng)：培養(yǎng)后，菌落被TTC染成紅色，而樣品顆粒不變色，方便計(jì)數(shù)；PCA中TTC的濃度不宜過(guò)高，否則會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。（特殊情況下方添加TTC，常規(guī)實(shí)驗(yàn)無(wú)須添加，特別是對(duì)于菌落數(shù)量較少的樣品不宜添加。方法來(lái)源依據(jù)為《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中菌落總數(shù)測(cè)定相關(guān)章節(jié)）

七、稀釋液：常采用0.85%氯化鈉溶液（生理鹽水），121℃、15min高壓滅菌后冷卻備用。

 八、傾注培養(yǎng)基時(shí)，根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)（同一類(lèi)型樣品的微生物檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)），若樣品有表面蔓延生長(zhǎng)的可能性，則待第一次傾注的瓊脂凝固后，可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計(jì)數(shù)。

九、水產(chǎn)品30±1℃培養(yǎng)72±3h；其它樣品36±1℃培養(yǎng)48±2h。注意：此處的“水產(chǎn)品”是指生魚(yú)片、魷魚(yú)干等未經(jīng)深度加工的水產(chǎn)品。

十、本標(biāo)準(zhǔn)的重難點(diǎn)為菌落計(jì)數(shù)及計(jì)算。

除標(biāo)準(zhǔn)中已說(shuō)明的要求外，有以下幾點(diǎn)需要注意：

   （1）菌落計(jì)數(shù)時(shí)，從低稀釋度的平板開(kāi)始計(jì)數(shù)。若所有平板上的菌落數(shù)均小于30CFU，則須計(jì)數(shù)所有平板上的菌落數(shù)，但僅采用最接近30CFU的兩個(gè)平板的菌落數(shù)來(lái)計(jì)算最終菌落總數(shù)。

以固體樣品舉例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過(guò)程及結(jié)果修約如下：

   （2）當(dāng)?shù)谝幌♂屘荻纫粋€(gè)板上菌落數(shù)高于30，另一個(gè)低于30，則依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)以介于30-300之間的菌落數(shù)作為該稀釋梯度的菌落數(shù)。（存在爭(zhēng)議，實(shí)際遇到該類(lèi)情況時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待）

以固體樣品舉例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過(guò)程及結(jié)果修約如下：

   （3）若所有平板上的菌落數(shù)均大于30CFU，則只計(jì)數(shù)30-300CFU之間的平板上的菌落數(shù)，并采用這些數(shù)據(jù)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給定的公式，進(jìn)行最終菌落總數(shù)的計(jì)算，此時(shí)將大于300CFU的記為“多不可計(jì)”，以“TNTC”表示。

以固體樣品舉例，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給定的公示，菌落數(shù)選取、計(jì)算過(guò)程及結(jié)果修約如下：

   （4）若所有稀釋度的平板菌落數(shù)都大于300，則不能所有都計(jì)為T(mén)NTC，必須將最高稀釋度的兩個(gè)平板上的菌落逐一地計(jì)數(shù)，再計(jì)算平均數(shù)，該平均數(shù)為該梯度的菌落總數(shù)，其余平板上的菌落數(shù)可記為T(mén)NTC。

以固體樣品舉例，菌落數(shù)選取、計(jì)算過(guò)程及結(jié)果修約如下：

   （5）計(jì)算菌落總數(shù)時(shí)，須嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行計(jì)算。

特殊情況：

① 若所有平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)。“最低稀釋倍數(shù)”并不是固定不變的，與檢驗(yàn)人員選取的稀釋度有關(guān)。如：某樣品多次檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)較高，檢驗(yàn)人員在梯度稀釋后取1:1000、1:10000、1:100000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板，最終所有平板上的均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則計(jì)算過(guò)程為＜1×1000，最終結(jié)果為＜1000CFU；若選取1:10、1:100、1:1000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板，均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則最終結(jié)果為＜10CFU。因此，稀釋度的選擇對(duì)于結(jié)果存在較大影響，選擇時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。

② 最低稀釋度兩個(gè)平板只有一個(gè)平板上長(zhǎng)了1個(gè)菌落，若為固體樣品且本次檢驗(yàn)的最低稀釋倍數(shù)為1:10，此時(shí)計(jì)算過(guò)程為（1+0）/2×10=5，由于默認(rèn)固體樣品最小檢出量為10CFU，故本次檢驗(yàn)的菌落總數(shù)結(jié)果為10CFU。注意：對(duì)于該情況一直存在爭(zhēng)議，不同的檢驗(yàn)人員可能做法不一，有人保留為5CFU，有人保留為10CFU，并無(wú)固定做法。（建議檢驗(yàn)人員保持一貫做法，不要隨意更改）

舉例如下：

十一、對(duì)于水產(chǎn)品、冷凍食品、速凍食品等菌落總數(shù)含量較高、限量值較大的食品類(lèi)別，建議多增加稀釋梯度（可稀釋至10-4甚至10-5），避免稀釋度較低、濃度較大導(dǎo)致培養(yǎng)后平板上菌落蔓延、彌散而難以計(jì)數(shù)甚至無(wú)法計(jì)數(shù)。

來(lái)源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于食品鑫焱公眾號(hào)

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