大腸菌群能力驗(yàn)證不會(huì)做？聽資深檢測(cè)人員按流程講解心得體會(huì)
發(fā)布時(shí)間：2023-07-04 瀏覽次數(shù)：2140
來(lái)源：“食品微生物檢測(cè)”公眾號(hào) 作者：岳正華
原標(biāo)題：大腸菌群能力驗(yàn)證不會(huì)做？聽資深檢測(cè)人員按流程講解心得體會(huì)
前不久，參加了中檢院“乳粉中大腸菌群的檢測(cè)能力驗(yàn)證”心情有點(diǎn)小緊張，此次大腸菌群以定量的方式進(jìn)行考核，樣品為2個(gè)，西林瓶真空包裝，呈白色凍干塊狀，每個(gè)樣等同于60.0mL的待測(cè)乳品樣品。
大腸能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
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收到樣品后，確認(rèn)樣品包裝是否完好，并將其保存在2~8℃冰箱中，然后在能力驗(yàn)證平臺(tái)進(jìn)行確認(rèn)。
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方法選擇和人員比對(duì)的探討：
根據(jù)能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書確定測(cè)試方法，樣品為待測(cè)乳品，乳品判定標(biāo)準(zhǔn)常采用平板法，首選GB4789.3-2016中第二法《大腸菌群平板計(jì)數(shù)法》。樣品稀釋梯度到10-4，第一法《大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法》作為方法比對(duì)，樣品稀釋梯度到10-6；與此同時(shí)，選擇快速紙片法做參考，紙片選取來(lái)自美國(guó)和日本兩個(gè)廠家的大腸菌群測(cè)試片進(jìn)行測(cè)定。
人員比對(duì)為兩人，分別選取市面上兩家不同廠家(如環(huán)凱生物)的培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)試比對(duì)。
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進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將樣品從冰箱中取出達(dá)到室溫后開啟使用，在生物安全柜下先用5mL稀釋液（選取的生理鹽水）進(jìn)行水化后吸入無(wú)菌瓶或袋中，再用剩余的55mL稀釋液進(jìn)行洗滌并轉(zhuǎn)入無(wú)菌瓶或袋中。
洗滌轉(zhuǎn)移時(shí)注意樣品瓶蓋的清洗和無(wú)菌操作，將60mL的樣品進(jìn)行均質(zhì)混勻，原液立刻進(jìn)行接種；再取25mL到225mL稀釋液中均質(zhì)混勻，制成10-1梯度樣品勻液，乳液中含有蛋白質(zhì)具有發(fā)泡性，均質(zhì)時(shí)易產(chǎn)生較多氣泡，會(huì)影響體積，導(dǎo)致結(jié)果偏低，為減少誤差可從原液中取25mL到225mL稀釋液中手動(dòng)混勻，混勻時(shí)注意觀察產(chǎn)生氣泡的多少。
用1mL無(wú)菌吸管取1:10的樣液到9mL生理鹽水試管中，制成1:100的樣液，以此類推。再將幾個(gè)稀釋度的樣液接種到無(wú)菌平皿和LST肉湯中。從樣品的制備到接種全程應(yīng)不超過(guò)15分鐘，然后在36℃中培養(yǎng)，平板和紙片24h，LST肉湯發(fā)酵管24~48h。
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在培養(yǎng)18h時(shí)觀察發(fā)酵管產(chǎn)氣情況，紙片和平板的菌落生長(zhǎng)情況并進(jìn)行初步計(jì)數(shù)，待時(shí)間到時(shí)進(jìn)行具體的菌落計(jì)數(shù)，在菌落數(shù)為15-150之間的平板上選取可疑的紫紅色較小菌落5個(gè)如圖（一）中黃圈標(biāo)注；選取紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)的較大典型菌落5個(gè)，如圖（一）中紅圈標(biāo)注；選取可疑紫紅色似有破痕的菌落5個(gè)，如圖（一）中藍(lán)圈標(biāo)注，進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)LST肉湯發(fā)酵管中產(chǎn)氣管進(jìn)行復(fù)發(fā)酵證實(shí)實(shí)驗(yàn)。為求準(zhǔn)確挑取圖一的下一個(gè)梯度平板上的所有菌落作確認(rèn)，如圖（二）。
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觀察可疑菌落在BGLB中產(chǎn)氣情況，如下圖（三），圖中菌落形態(tài)小的產(chǎn)氣量最大，菌落形態(tài)大的反而產(chǎn)氣量最小，說(shuō)明產(chǎn)氣量多少不以其形態(tài)的大小來(lái)衡量，而是以菌含量的高低判斷。
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結(jié)果的計(jì)算和對(duì)比:
對(duì)上述結(jié)果分析可知采用兩個(gè)不同廠家的培養(yǎng)基進(jìn)行平板法和MPN法測(cè)試，檢驗(yàn)結(jié)果未見顯著差異。采用紙片法，不論是國(guó)外廠家還是國(guó)內(nèi)廣東環(huán)凱廠家的大腸菌群測(cè)試片在低濃度時(shí)，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法差異不大，但是隨著樣品濃度的增加，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)國(guó)標(biāo)法有較大的差異。其中紙片作為一種快速測(cè)試方法，其優(yōu)越性也顯而易見，操作簡(jiǎn)單，判讀明確，縮短檢測(cè)時(shí)間，可作為一種快速篩選的方法。
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在對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析后，選取平板法的檢測(cè)結(jié)果的平均值進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)提交。
最后，收到中期報(bào)告，兩個(gè)樣的Z值分別為+0.1和-0.3，在偏差±2.0范圍內(nèi)結(jié)果滿意。
望此次試驗(yàn)經(jīng)歷和心得能夠給與做微生物的小伙伴們一點(diǎn)小小借鑒，同時(shí)也希望同行給與更多的建議。
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