在食品安全領(lǐng)域，病毒污染一直是全球關(guān)注的焦點。諾如病毒，作為一種極具傳染性的病原體，是導(dǎo)致全球約18%腹瀉病例的主要原因之一。它具有低感染劑量、快速發(fā)作和強(qiáng)大的傳播能力，給公共衛(wèi)生帶來了巨大挑戰(zhàn)。然而，傳統(tǒng)的檢測方法依賴于昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的操作流程，難以滿足快速、現(xiàn)場檢測的需求。最近，一項結(jié)合了CRISPR技術(shù)與逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（RT-LAMP）的創(chuàng)新檢測方法，為這一難題帶來了新的解決方案。
諾如病毒：食品安全的重大威脅
諾如病毒是一種單股正鏈RNA病毒，屬于杯狀病毒科。其基因組包含三個開放閱讀框（ORFs），其中ORF1編碼六種非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2和ORF3分別編碼兩種結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2。該病毒在全球范圍內(nèi)廣泛分布，尤其在醫(yī)院、學(xué)校和郵輪等人員密集場所，一旦暴發(fā)，極易引發(fā)大規(guī)模感染。據(jù)統(tǒng)計，僅在美國，每年就有約2100萬人感染諾如病毒，其中超過70000人需要住院治療，超過800人死亡。在中國，諾如病毒也是導(dǎo)致食源性疾病的重要因素之一，給社會經(jīng)濟(jì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。
傳統(tǒng)檢測方法的局限性
目前，檢測諾如病毒的方法主要包括免疫學(xué)檢測、核酸擴(kuò)增技術(shù)（如PCR和qPCR）以及基因測序等。然而，這些方法存在一些局限性。免疫學(xué)方法操作相對簡單，但特異性差，對病毒變異適應(yīng)性弱，靈敏度低，易產(chǎn)生假陽性和假陰性結(jié)果。qPCR雖靈敏度高，但設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，對溫度控制要求高，檢測時間長，難以在基層和現(xiàn)場應(yīng)用。此外，這些方法對食品基質(zhì)干擾敏感，成本較高，難以滿足現(xiàn)場快速檢測需求。這些局限性限制了傳統(tǒng)方法在實際應(yīng)用中的廣泛推廣，特別是在資源有限的地區(qū)。
CRISPR/Cas12技術(shù)：為病毒檢測帶來新曙光
CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列）技術(shù)近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了重大突破，其在分子診斷中的應(yīng)用尤其引人注目。CRISPR/Cas系統(tǒng)由引導(dǎo)RNA（gRNA）、CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）和目標(biāo)序列組成，當(dāng)gRNA與目標(biāo)序列匹配時，會激活Cas蛋白的切割活性，進(jìn)而產(chǎn)生可檢測的信號。這種技術(shù)具有高度的特異性和靈敏度，能夠精準(zhǔn)識別目標(biāo)核酸序列，為病毒檢測提供了新的思路和方法。
在這項研究中，研究人員將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（RT-LAMP）技術(shù)與CRISPR/Cas12技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出一種快速、靈敏的諾如病毒檢測方法。RT-LAMP技術(shù)能夠在較短時間內(nèi)完成核酸擴(kuò)增，而CRISPR/Cas12技術(shù)則進(jìn)一步提高了檢測的特異性和靈敏度。這種組合方法不僅操作簡便，而且對設(shè)備要求低，適合在基層檢測機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場快速檢測中應(yīng)用。
圖1 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（RT-LAMP）/ CRISPR/Cas12a 方法檢測諾如病毒（NOV）的示意圖。
檢測方法的優(yōu)勢與創(chuàng)新
研究人員開發(fā)的RT-LAMP/CRISPR Cas12a檢測系統(tǒng)具有多項顯著優(yōu)勢。首先，該系統(tǒng)僅需兩個反應(yīng)溫度，整個檢測過程可在60分鐘內(nèi)完成，大大縮短了檢測時間。其次，該方法對不同食品基質(zhì)的干擾具有較強(qiáng)的抵抗力，能夠準(zhǔn)確檢測出被諾如病毒污染的食品樣本。此外，該檢測系統(tǒng)還具有較高的靈敏度和特異性，對于諾如病毒GI和GII的檢測靈敏度分別達(dá)到32.8拷貝/反應(yīng)和22.8拷貝/反應(yīng)。這意味著即使在病毒含量較低的情況下，也能夠及時發(fā)現(xiàn)污染，從而有效防止病毒的進(jìn)一步傳播。
圖2 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（RT-LAMP）/CRISPR/Cas12a 的特異性和靈敏度。所有數(shù)值均為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（SD），重復(fù)次數(shù)(n=6)。（a）諾如病毒（NOV）GI 型的檢測范圍；（b）NOV GII 型的檢測范圍；（c）NOV GI 型的特異性；（d）NOV GII 型的特異性。Fl 為熒光。
實驗驗證與應(yīng)用前景
為了驗證該檢測方法的有效性，研究人員進(jìn)行了大量實驗。他們選擇了三種不同的食品樣本：生蔬菜、胡蘿卜和蛤蜊，并人為添加了已知濃度的諾如病毒RNA。實驗結(jié)果表明，RT-LAMP/CRISPR Cas12a系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確檢測出所有陽性樣本，且未在未污染的對照樣本中檢測到信號。這表明該方法具有較高的穩(wěn)定性和可靠性，能夠滿足實際檢測需求。
此外，該檢測系統(tǒng)還具有一定的通用性，通過簡單更換引物和gRNA，可以針對其他核酸目標(biāo)進(jìn)行檢測。這意味著該技術(shù)不僅可以用于諾如病毒的檢測，還可以擴(kuò)展到其他食源性病毒的檢測，為食品安全檢測提供了一個強(qiáng)大的工具。
圖3 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（RT-LAMP）/ CRISPR/Cas12a 檢測人工污染食品樣本的結(jié)果。頂部為逆轉(zhuǎn)錄定量實時 PCR（RT-qPCR）的 Ct 值，熱圖顯示熒光強(qiáng)度，底部為人工 RNA 靶標(biāo)的數(shù)量。（a）為諾如病毒（NOV）GI 型的檢測結(jié)果，（b）為 NOV GII 型的檢測結(jié)果。
未來展望
這項研究的成功不僅為諾如病毒的快速檢測提供了一種新的技術(shù)手段，也為其他食源性病毒的檢測開辟了新的思路。通過簡單地更換引物和crRNA，該檢測平臺可以輕松擴(kuò)展到其他病毒的檢測，具有很強(qiáng)的通用性和靈活性。此外，該方法還可以與小型化、便攜式的檢測設(shè)備結(jié)合，進(jìn)一步提高其在資源有限地區(qū)的應(yīng)用價值。
參考文獻(xiàn)：Gou S, Liu Y, Li Q, et al. CRISPR/Cas12‐mediated detection of GI and GII Norovirus in different food samples[J]. Journal of Food Science, 2025, 90(3): e70160.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
