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一、大腸菌群定義和衛(wèi)生學(xué)意義
大腸菌群定義：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名，它不代表某一種或某一屬的細(xì)菌，而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。這群細(xì)菌包括：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬（又叫產(chǎn)氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌）和等。
衛(wèi)生學(xué)意義：大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評價樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險性。直接反映了樣品受糞便污染的的程度。
二、GB4789.3-2016大腸菌群MPN法
1. 什么是MPN法？
?MPN法是統(tǒng)計學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。
?MPN值并不能表示實際菌落數(shù)， 實際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點，MPN值是落在這個置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點。
?靈敏度較高，適用于污染菌落較少的樣品。
2. 大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗操作
3. 培養(yǎng)基原理解析
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）
?月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長，胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。
?36±1℃培養(yǎng)24h后若已產(chǎn)氣，則可停止培養(yǎng)。如果沒有觀察到有產(chǎn)氣的現(xiàn)象，則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h。
?如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯。
- +
煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）
?膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長。
?培養(yǎng)基配方當(dāng)中含有膽鹽，大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會與膽鹽發(fā)生反應(yīng)，形成膽酸沉淀。培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色。
陰性 陽性
4. 大腸菌群最大可能數(shù)（MPN）報告
?確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。
?當(dāng)實驗結(jié)果在MPN表中無法查找到MPN值時，如：陽性管數(shù)為122，123，232，233等時，建議增加稀釋度（可做4~5個稀釋度），使樣品最高稀釋度能達(dá)到陰性終點(如果污染程度不能判定，則多加一稀釋度），然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行查找，最終確定MPN值。
表:大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表
陽 性 管 數(shù) | MPN | 95%可 信 限 | 陽 性 管 數(shù) | MPN | 95%可 信 限 | ||||||
0.10 | 0.01 | 0.001 | 下 限 | 上 限 | 0.10 | 0.01 | 0.001 | 下 限 | 上 限 | ||
0 | 0 | 0 | <3.0 | — | 9.5 | 2 | 2 | 0 | 21 | 4.5 | 42 |
0 | 0 | 1 | 3.0 | 0.15 | 9.6 | 2 | 2 | 1 | 28 | 8.7 | 94 |
0 | 1 | 0 | 3.0 | 0.15 | 11 | 2 | 2 | 2 | 35 | 8.7 | 94 |
0 | 1 | 1 | 6.1 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 0 | 29 | 8.7 | 94 |
0 | 2 | 0 | 6.2 | 1.2 | 18 | 2 | 3 | 1 | 36 | 8.7 | 94 |
0 | 3 | 0 | 9.4 | 3.6 | 38 | 3 | 0 | 0 | 23 | 4.6 | 94 |
1 | 0 | 0 | 3.6 | 0.17 | 18 | 3 | 0 | 1 | 38 | 8.7 | 110 |
1 | 0 | 1 | 7.2 | 1.3 | 18 | 3 | 0 | 2 | 64 | 17 | 180 |
1 | 0 | 2 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 0 | 43 | 9 | 180 |
1 | 1 | 0 | 7.4 | 1.3 | 20 | 3 | 1 | 1 | 75 | 17 | 200 |
1 | 1 | 1 | 11 | 3.6 | 38 | 3 | 1 | 2 | 120 | 37 | 420 |
1 | 2 | 0 | 11 | 3.6 | 42 | 3 | 1 | 3 | 160 | 40 | 420 |
1 | 2 | 1 | 15 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 0 | 93 | 18 | 420 |
1 | 3 | 0 | 16 | 4.5 | 42 | 3 | 2 | 1 | 150 | 37 | 420 |
2 | 0 | 0 | 9.2 | 1.4 | 38 | 3 | 2 | 2 | 210 | 40 | 430 |
2 | 0 | 1 | 14 | 3.6 | 42 | 3 | 2 | 3 | 290 | 90 | 1000 |
2 | 0 | 2 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 0 | 240 | 42 | 1000 |
2 | 1 | 0 | 15 | 3.7 | 42 | 3 | 3 | 1 | 460 | 90 | 2000 |
2 | 1 | 1 | 20 | 4.5 | 42 | 3 | 3 | 2 | 1100 | 180 | 4100 |
2 | 1 | 2 | 27 | 8.7 | 94 | 3 | 3 | 3 | >1100 | 420 | — |
注1:本 表 采 用3個 稀 釋 度[0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)],每 個 稀 釋 度 接 種3管 。 注2:表 內(nèi) 所 列 檢 樣 量 如 改 用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時,表 內(nèi) 數(shù) 字 應(yīng) 相 應(yīng) 降 低10倍;如 改 用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)時,則 表 內(nèi) 數(shù) 字 應(yīng) 相 應(yīng) 增 高10倍,其 余 類 推 。 | |||||||||||
三、GB4789.3-2016大腸菌群計數(shù)平板法
1. 大腸菌群平板計數(shù)法流程圖
2. 培養(yǎng)基原理解析
結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
?配方中膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌，中性紅作為指示劑，在酸性條件下為紫紅色。
?大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結(jié)合，可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)。
?該培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。
大腸埃希氏菌ATCC25922在VRBA上的菌落形態(tài)
3. 計數(shù)典型和可疑菌落數(shù)
結(jié)果判讀：選取菌落數(shù)在15 CFU～150 CFU之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm或更大。
證實試驗：從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。
4. 大腸菌群平板計數(shù)的報告
?經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。
?若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。
四、質(zhì)量控制
1. 實驗室過程中，每批樣品稀釋液都要做空白對照。
2. 為了控制環(huán)境污染，每次檢驗過程中，于檢驗臺上打開兩塊計數(shù)瓊脂平板，并在檢驗環(huán)境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時進(jìn)行培養(yǎng)，以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。
3. 定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應(yīng)定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M(jìn)行陽性實驗驗證，并進(jìn)行記錄，次驗證實驗至少每2個月進(jìn)行1次。
五、大腸菌群測試片法
1. 原理：大腸菌群檢測片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐，其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層（營養(yǎng)物質(zhì)、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑）和透明隔水膜組成，經(jīng)輻照滅菌。可用于食品、飲料等的大腸菌群計數(shù)。含有四氮唑指示劑菌落為紅色，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。
2. 特點優(yōu)勢
?菌落計數(shù)特別方便（容易判讀），紅色菌落，易于食品顆粒分開，無菌落重疊現(xiàn)象；
?菌落分布特別均勻；
?避免了培養(yǎng)基對細(xì)菌熱損傷有關(guān)；
?菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生
?經(jīng)濟(jì)環(huán)保 無粉塵，體積小，重量輕，易儲運(yùn)
?保質(zhì)期長干制無水培養(yǎng)基，性質(zhì)穩(wěn)定，保質(zhì)期更長
六、所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株
用途 | 貨號 | 名稱 | 規(guī)格 |
樣品稀釋 | CP0630 | 生理鹽水 | 盒（袋裝）225 mL×10袋 |
CP0511A | 磷酸鹽緩沖液（PBS） | 盒（瓶裝）225 mL×6瓶 | |
CP0640 | 磷酸鹽緩沖液（PBS） | 盒（袋裝）225 mL×10袋 | |
022117 | 磷酸鹽緩沖液（PBS） | 瓶（干粉）250 g | |
CP0310 | 生理鹽水 | 盒（管裝）9 mL×20支 | |
MPN法計數(shù)初發(fā)酵試驗 | 022210 | 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） | 瓶（干粉）250g |
022210P1 | 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST) | 瓶（顆粒）250 g | |
022210A | 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） | 盒（管裝）10 mL×20支 | |
22210G1 | 雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯 | 盒（管裝）10 mL×20支 | |
平板計數(shù) | 022221 | 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） | 瓶（干粉）250g |
022221P1 | 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） | 瓶（顆粒）250g | |
C22221B1 | 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板 | 盒（平板）90 mm×20 | |
MPN法復(fù)發(fā)酵和平板計數(shù)證實 | 022220 | 煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） | 瓶（干粉）250g |
022220P1 | 煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB) | 瓶（顆粒）250g | |
022220A | 煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） | 盒（管裝）10 mL×20支 | |
HANDYPLAT微生物測試片 | HP002 | 大腸菌群測試片 | 20片/包 |
Q-Strain定量質(zhì)控菌株 | QS011A | 大腸埃希氏（ATCC25922） | 110-1100 CFU/瓶 |
QS011B | 大腸埃希氏菌（ATCC25922） | (0.6-2.0)×107CFU/瓶 |
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