小腸結腸炎耶爾森氏菌的生物學特性

生物學特性：小腸結腸炎耶爾森菌革蘭氏染色陰性，菌體呈球桿狀，不形成芽孢，22℃~30℃培養(yǎng)時周身可形成豐富鞭毛，需氧厭氧條件均可生長，生長范圍溫度0℃~45℃，最佳生長溫度為26℃。

流行學特征：是一種人獸共患病原菌，廣泛分布于自然界中，在海產(chǎn)品、蛋類、鮮奶、飲料、速凍食品中可分離到該菌，是冰箱中存放食物的重要污染菌，被稱為“冰箱菌”；主要通過人畜接觸和糞口途徑傳播，感染后主要癥狀為腹瀉、腸炎等，還能引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼、結締組織和其他一些全身性疾病癥狀。

小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢驗

增菌
? 以無菌操作取25g(或25mL)樣品放入含有225mL改良磷酸鹽緩沖液增菌液的無菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋內(nèi)，以8000r/min均質(zhì)1min或拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min。
? 液體樣品或粉末狀樣品，應振蕩混勻。均質(zhì)后于26℃1℃增菌48h~72h。增菌時間長短可根據(jù)對樣品污染程度的估計來確定。

堿處理
? 除乳與乳制品外，其他食品的增菌液0.5mL與堿處理液4.5mL充分混合15s。

分離培養(yǎng)
? 將乳與乳制品增菌液或經(jīng)過堿處理的其他食品增菌液分別接種于CIN-1瓊脂平板和改良Y瓊脂平板，26℃±1℃培養(yǎng)48h±2h 。
? 注意事項：在CIN-1瓊脂平板和改良Y瓊脂平板上劃線分離時，應三區(qū)劃線，且線條稀疏不宜過密，以免雜菌生長過大，掩蓋可疑小腸結腸炎耶爾森菌的檢出；

培養(yǎng)基原理解析

1、改良磷酸鹽緩沖液

? 山梨醇提供碳氮源，磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉為緩沖液，膽鹽抑制革蘭氏陽性菌，氯化鈉提供細胞所需要的滲透壓。

2、CIN-1瓊脂
? 胰胨和酵母浸膏提供氮源和微量元素；甘露醇為可發(fā)酵糖；去氧膽酸鈉和結晶紫抑制革蘭氏陽性菌；中性紅是pH指示劑；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。。
? 小腸結腸炎耶爾森菌菌落為深紅色中心，周圍具有無色透明圈（紅色牛眼狀菌落），菌落大小為1-2mm。

小腸結腸炎耶爾森菌菌落深紅色，周圍具有無色透明圈（紅色牛眼狀菌落）

3、改良Y瓊脂
? 蛋白胨和水解酪蛋白提供氮源和微量元素；乳糖用于糖發(fā)酵試驗；氯化鈉維持正常的滲透壓，去氧膽酸鈉和三號膽鹽抑制革蘭氏陽性菌；丙酮酸鈉刺激目標菌的生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。
? 小腸結腸炎耶爾森菌菌落為無色透明、不黏稠菌落。

小腸結腸炎耶爾森菌無色透明，不粘稠。

CRM017 小腸結腸炎耶爾森氏菌在顯色培養(yǎng)基上菌落特征
致病性小腸結腸炎耶爾森氏菌→淡紫色	非致病性小腸結腸炎耶爾森氏菌和（枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬、氣單胞菌屬等菌）→金屬藍色，在金屬藍色菌中生長被抑制或限制

小腸結腸炎耶爾森氏菌生化鑒定原理解析

1、改良克氏雙糖試驗

? 操作方法：分別挑取可疑菌落3個~5個，分別接種于改良克氏雙糖瓊脂，接種時先在斜面劃線，再于底層穿刺，26℃±1℃培養(yǎng)24h 。

? 改良克氏雙糖瓊脂：蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏提供氮源、維生素、礦物質(zhì)；山梨醇、葡萄糖提供可發(fā)酵糖類；硫代硫酸鈉可被某些細菌還原成H2S，與鐵離子生成黑色硫化鐵；酚紅是pH指示劑，發(fā)酵糖產(chǎn)酸變黃，產(chǎn)堿變紅；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

小腸結腸炎耶爾森菌在改良克氏雙糖瓊脂上的特征	大腸埃希氏菌在改良克氏雙糖瓊脂上的特征

? 小腸結腸炎耶爾森菌在改良克氏雙糖瓊脂上的特征斜面底層變黃不產(chǎn)氣。

? 注意事項：先在斜面劃線，再與底層穿刺。由于培養(yǎng)36~48h后小腸結腸炎耶爾森菌會產(chǎn)堿，造成斜面變紅，因此應注意培養(yǎng)時效，在培養(yǎng)24h時觀察結果；

2、尿素酶實驗

? 操作方法：用接種環(huán)挑取一滿環(huán)可疑培養(yǎng)物，接種到尿素培養(yǎng)基，接種量要足夠大，26℃±1℃培養(yǎng)2h~4h，若陽性不明顯，則繼續(xù)培養(yǎng)到24h后再觀察。

? 尿素酶試驗原理：具有尿素酶的細菌分解培養(yǎng)基中的尿素，產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)呈堿性，酚紅指示劑在pH6.8時呈黃色，pH8.1呈粉紅色。

? 結果判讀：陽性為玫紅色；  陰性為淡橙紅色-淡黃色。

? 注意事項：接種量足夠大。

3、動力實驗

? 操作方法：將尿素酶試驗陽性菌落分別接種于兩管半固體培養(yǎng)基中，于26℃±1℃和36℃±1℃培養(yǎng)24h。

? 動力觀察原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、礦物質(zhì)；氯化鈉維持均衡的滲透壓；較少量的瓊脂作為培養(yǎng)基的凝固劑。

? 結果判讀：測試菌有動力的話，就會沿穿刺線擴散生長，無動力就不會擴散生長。

? 小腸結腸炎耶爾森氏菌26℃±1℃溫度下有動力，擴散生長； 36℃±1℃溫度下沒動力，不擴散沿穿刺線生長；

4、革蘭氏染色鏡檢

? 操作方法：將在26℃有動力而36℃無動力的可疑菌培養(yǎng)物劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板,進行純化培養(yǎng)，用純化物進行革蘭氏染色鏡檢和生化試驗。

? 小腸結腸炎耶爾森氏菌呈革蘭氏陰性球桿菌,有時呈橢圓或桿狀,大小為(0.8μm~3.0μm)×0.8μm

小腸結腸炎耶爾森氏菌與其他相似菌的生化鑒別表

其他相似菌生化鑒定

1、糖（醇）發(fā)酵試驗

? 絕大多數(shù)細菌都能利用糖（醇）類作為碳源和能源，但是它們在分解糖（醇）的能力上有很大的差異，有些細菌能分解某種糖（醇）并產(chǎn)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來斷定。

? （指示劑為溴甲酚紫）結果判讀：陽性為變黃色；陰性為紫色。

2、葡萄糖磷酸鹽胨水（VP試驗）

? 某些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并進一步將丙酮酸脫羧成為乙酰甲基甲醇，后面在堿性環(huán)境下被空氣中的氧氧化成為二乙酰，進而與培養(yǎng)基中的精氨酸等所含的胍基結合，形成紅色的化合物，即VP試驗陽性。

? 小腸結腸炎耶爾森氏菌VP陽性。

3、鳥氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基

? 具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（鳥氨酸→腐胺）和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿，使指示劑顯示出來。

? 結果判讀：陽性為試驗管為綠色-藍綠色，對照管變黃色；  陰性為試驗管和對照管均變黃色，或均不變色。

小腸結腸炎耶爾森氏菌生化鑒定盒（GB 4789.8-2016）

? 生化反應管：半固體瓊脂、尿素（凍干）、葡萄糖磷酸鹽胨水、鳥氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧酶對照、蔗糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、鼠李糖。

? 配套試劑：無菌液體石蠟，VP試劑（甲液：6% α-萘酚乙液：40%氫氧化鉀溶液），無菌水、生理鹽水，麥氏比濁管。

小腸結腸炎耶爾森氏菌血清型鑒定（選做項目）

1、檢查培養(yǎng)物有無自凝性

? 使用接種在1.2%~1.5%固體瓊脂平板上的新鮮培養(yǎng)物。在潔凈玻片上滴加一滴生理鹽水，將待測試培養(yǎng)物混合于生理鹽水滴內(nèi)，使之成為均一性的混濁懸液，將玻片輕輕搖動30~60s，黑色背景下觀察反應，若出現(xiàn)可見菌體凝集，即可認為有自凝性，反之無自凝性。無自凝性的參照下面方法繼續(xù)鑒定。

2、血清型（O）鑒定

使用接種在1.2%~1.5%固體瓊脂平板上的新鮮培養(yǎng)物，在玻片上劃出2個約1cm×2cm 的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴O因子血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌苔研成乳狀液。將玻片傾斜輕輕搖動混合30~60s，并對著黑色背景進行觀察，如O因子血清在2min內(nèi)出現(xiàn)比較明顯的小顆粒凝集者，且生理鹽水區(qū)無凝集現(xiàn)象，即為陽性反應，反之為陰性反應。

小腸結腸炎耶爾森氏菌恒溫熒光核酸快速檢測法

全程最快僅需10h即可出檢測結果；最低檢測限為10-20CFU??！

質(zhì)量控制及疑難解析

質(zhì)量控制

1、實驗室過程中，每批預增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。

2、定期使用小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC(B)52204或相應定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當?shù)氖称窐悠愤M行陽性實驗驗證，污染劑量應控制在10-100CFU/25g，并進行記錄，驗證實驗至少每2個月進行1次。

3、每2個月將所使用的培養(yǎng)基和生化試劑用小腸結腸炎耶爾森氏菌的標準菌株或陰性菌株（如大腸桿菌ATCC25922）進行驗證，并進行記錄。

疑難解析

問：在前增菌或選擇性增菌結束后，肉湯未見微生物生長，是否可以終止實驗？
答：不可以，因為肉湯可見的細菌濃度為107CFU/ml，在此濃度一下，肉眼不能發(fā)現(xiàn)微生物生長，但實際溶液中有微生物生長。

問：為什么除乳制品外，其他食品前處理都要進行堿處理?
答：小腸結腸炎耶爾森氏菌相對耐堿，堿處理降低雜菌干擾，提出檢出率；牛奶加減會使蛋白質(zhì)變性成團，增加檢出難度，故不需堿處理。 

問：為什么使用VITEK 2 Compact 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)不能準確鑒定出小腸結腸炎耶爾森氏菌?
答：可以鑒定到屬，不能鑒定到種，還需結合其他生化進一步鑒定到種。

所需培養(yǎng)基試劑