相信很多老師在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，都遇到過細(xì)胞養(yǎng)著養(yǎng)著，在顯微鏡下觀察到小黑點(diǎn)，背景比較臟，那么顯微鏡下觀察到了小黑點(diǎn)，是細(xì)胞碎片還是污染？

    細(xì)胞小黑點(diǎn)判斷   

運(yùn)動(dòng)性：很多會(huì)動(dòng)的小黑點(diǎn)，只是發(fā)生布朗運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞碎片。從運(yùn)動(dòng)性上比較，浮躁的細(xì)菌活躍的多。

培養(yǎng)基的渾濁度：如果在顯微鏡下無法辨認(rèn)，那就交給時(shí)間吧。細(xì)胞培養(yǎng)基對于細(xì)菌來說是非常營養(yǎng)的大餐。一旦發(fā)生污染，細(xì)菌就會(huì)大量繁殖。培養(yǎng)基PH值迅速下降，培養(yǎng)基變黃且會(huì)變渾濁。通常在12小時(shí)內(nèi)就可以發(fā)現(xiàn)，而在48小時(shí)內(nèi)就非常明顯。被污染的細(xì)胞培養(yǎng)基變黃且渾濁、未被污染的細(xì)胞培養(yǎng)基偏紅且澄清。

接種平板：將懷疑污染物接種在微生物培養(yǎng)平板中，觀察菌落形成情況。碎片or細(xì)菌？一目了然。

     處理與預(yù)防    

1.細(xì)胞碎片

化學(xué)或者物理的強(qiáng)烈刺激（例如胰酶消化時(shí)間過長，吹打細(xì)胞太過用力等）往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，產(chǎn)生很多的細(xì)胞碎片。在顯微鏡下進(jìn)行觀察時(shí)，可以看到很多呈不規(guī)則形態(tài)、沒有光澤的顆粒粘附在細(xì)胞培養(yǎng)皿的底部。

預(yù)防方法

狀態(tài)不好的細(xì)胞往往貼壁能力較強(qiáng)，因此切勿用移液器進(jìn)行強(qiáng)力的吹打，從而損害了健康的細(xì)胞；另外，控制好胰酶消化的時(shí)間，只需保證大部分正常的細(xì)胞被消化下來就可以了，然后更換新的細(xì)胞培養(yǎng)皿。

處理方法

a. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，折光屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變。

b. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞已經(jīng)分泌的分泌泡，可以先換液后用PBS潤洗清除，潤洗不能清除的，可以消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液750rpm 離心4min，棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

2.細(xì)菌污染

細(xì)菌污染的細(xì)胞，培養(yǎng)基會(huì)明顯渾濁，靜置后會(huì)在底部形成一層沙狀物，顯微鏡下觀察細(xì)胞被細(xì)菌包圍死亡。

處理方法

細(xì)菌污染檢測，可以取細(xì)胞培養(yǎng)上清1ml左右，接種到3ml LB培養(yǎng)基，搖菌過夜。若培養(yǎng)基明顯變渾濁，則證明細(xì)菌污染；若無明顯變色，證明無污染。

細(xì)菌污染的細(xì)胞處理后及時(shí)丟棄，不會(huì)對其他細(xì)胞造成影響。

細(xì)胞碎片應(yīng)注意與細(xì)菌、真菌污染區(qū)分，主要區(qū)別在于細(xì)胞碎片不會(huì)明顯增殖，而細(xì)菌、真菌在過夜后即可明顯觀察到增殖，甚至完全遮蔽細(xì)胞。

細(xì)菌污染一般在污染源進(jìn)入后1-2天即可爆發(fā)，故發(fā)現(xiàn)污染時(shí)可以自行溯源。

3.真菌污染

真菌污染的細(xì)胞，顯微鏡下可以明顯看到樹枝狀霉菌菌絲或其他形態(tài)的菌體，肉眼可以看到明顯白色斑點(diǎn)或者培養(yǎng)基內(nèi)顆粒狀物質(zhì)漂浮。

真菌無須檢測，顯微鏡及肉眼即可分辨。

處理方法

真菌污染的細(xì)胞，處理后及時(shí)丟棄，同時(shí)需要對培養(yǎng)箱及操作臺(tái)進(jìn)行消毒處理，避免污染其他細(xì)胞。

真菌污染一般在污染源進(jìn)入2-4天內(nèi)即可爆發(fā)，發(fā)現(xiàn)污染時(shí)可以自行溯源。

4.支原體污染

支原體污染在國內(nèi)是普遍存在的問題，大部分實(shí)驗(yàn)室缺乏檢測及控制支原體污染的方法，導(dǎo)致有很大比例的細(xì)胞含有支原體污染。

檢測方法

支原體檢測方式多種多樣，PCR、熒光法、培養(yǎng)法、試劑盒等，不同實(shí)驗(yàn)方式檢測的靈敏度、特異性、針對的支原體類型都不太一樣，所以各種檢測方法檢出結(jié)果有時(shí)會(huì)有出入。即同一個(gè)樣本，有的方法檢出陽性，有的陰性，有的強(qiáng)有的弱。

支原體處理的，用6孔板培養(yǎng)，每天換液，細(xì)胞長滿就傳代丟棄部分，基本可以保證2-3周清除干凈。

5.凋亡小體

體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞很容易受到培養(yǎng)環(huán)境因素的影響，例如營養(yǎng)成分的改變、氧的供給、毒素、細(xì)胞代謝產(chǎn)物的積累、pH、 剪切力、細(xì)胞密度及微生物污染等。這些環(huán)境的改變都有可能誘發(fā)細(xì)胞的凋亡，從而產(chǎn)生很多分泌的凋亡小體。凋亡小體大多游離在培養(yǎng)基中，但也有一些會(huì)通過暴露的核酸彼此之間相互黏連，從而形成一個(gè)棕色的凋亡小體團(tuán)塊，沒有細(xì)胞光澤。

處理建議

細(xì)胞培養(yǎng)的過程中一定要控制細(xì)胞傳代的時(shí)間，不能讓細(xì)胞"長過"；不要使用過酸或者過堿的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；選用內(nèi)毒素含量較低的血清。

6.血清中的沉淀

磷酸鈣是常見的一種沉淀物，通常會(huì)使血清出現(xiàn)渾濁，并且在37℃培養(yǎng)的時(shí)候會(huì)增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點(diǎn)，這些小黑點(diǎn)由于布朗運(yùn)動(dòng)看上去可以活動(dòng)，因此經(jīng)常被誤認(rèn)為是微生物污染。

處理建議

經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多，對于大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要進(jìn)過高溫滅活處理的。

    溫馨提示   

? 哪些步驟最容易發(fā)生污染

最容易導(dǎo)致細(xì)菌污染的一個(gè)步驟就是細(xì)胞在水浴鍋解凍后沒有徹底消毒。如果這個(gè)步驟發(fā)生污染的話，細(xì)胞接種24小時(shí)之內(nèi)就會(huì)明顯觀察到細(xì)胞污染。

另外幾個(gè)可能導(dǎo)致污染的操作是：放培養(yǎng)基的瓶子或者管子在用水浴鍋預(yù)熱后，沒有徹底消毒。實(shí)驗(yàn)員在操作過程中槍頭有可能接觸到被污染的部分而導(dǎo)致細(xì)胞污染。為了防止這種情況，容器外表面包括帽子應(yīng)噴灑75%乙醇徹底消毒，然后用無菌棉墊擦干。

實(shí)驗(yàn)員在操作過程中，移液器的槍尖可能會(huì)碰到超菌臺(tái)內(nèi)壁或者超菌臺(tái)內(nèi)放置的其他瓶子或設(shè)備，有時(shí)可能會(huì)碰到包含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶外表面，甚至?xí)龅绞痔祝蛘邔?shí)驗(yàn)操作服的袖口。以上所提到的任何一項(xiàng)操作失誤，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌污染。

? 保持無菌工作區(qū)是防止污染最佳方式

1. 使用前和使用后，用75%乙醇對所有工作表面進(jìn)行消毒。如果操作過程發(fā)生液體溢出的情況，這一項(xiàng)特別重要；

2. 保持一個(gè)整潔的工作空間，工作區(qū)應(yīng)該只包含必須的實(shí)驗(yàn)設(shè)備；

3. 在實(shí)驗(yàn)之前確保已經(jīng)準(zhǔn)備好所有需要的試劑和耗材，避免反復(fù)進(jìn)出操作區(qū)；

4. 經(jīng)常清潔用于細(xì)胞培養(yǎng)的水浴鍋，經(jīng)常對細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒。

? 培養(yǎng)基污染應(yīng)該怎么處理

1. 在使用前和使用后，用75%乙醇對培養(yǎng)基和其他試劑瓶子的外表面進(jìn)行消毒。此外，不要讓試劑瓶口敞開過長時(shí)間；

2. 盡可能將培養(yǎng)基和其他需要的試劑分裝，如果在操作過程中發(fā)生錯(cuò)誤操作，最好不再使用；

3. 在操作培養(yǎng)基時(shí)，請使用一次性的塑料或者玻璃的無菌移液管。每個(gè)吸管只有一次，以避免交叉污染；

4. 每天用顯微鏡觀察細(xì)胞，密切注意培養(yǎng)基的渾濁度；

5. 避免和其他人共同使用培養(yǎng)基和其他試劑；

6. 每個(gè)細(xì)胞系使用一瓶培養(yǎng)基。這樣可以有效避免交叉污染；

7. 一次只操作一個(gè)細(xì)胞系，避免細(xì)胞之間的交叉污染。

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