人—乳腺組織細(xì)胞懸液制備流程
發(fā)布時(shí)間：2023-06-02 瀏覽次數(shù)：941
乳腺是乳房中的主要結(jié)構(gòu)成分，以乳頭為中心呈放射狀分布于乳房組織中。乳腺屬于外分泌腺，由腺泡和導(dǎo)管構(gòu)成。乳腺的實(shí)質(zhì)被結(jié)締組織分隔成15~25個(gè)乳腺葉，每個(gè)乳腺葉又被分隔成若干個(gè)乳腺小葉，每個(gè)小葉為一個(gè)復(fù)管泡狀腺。小葉間結(jié)締組織內(nèi)含有大量的脂肪細(xì)胞。
乳腺示意圖
實(shí)驗(yàn)儀器及耗材：恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、移液管、移液槍、手術(shù)刀、搖床、膠原酶Ⅰ粉末、DMEM、50mL離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、脫氧核糖核酸酶Ⅰ、RPMI 1640、PBS 1X、Antibiotic-Antimycotic、PBS
試劑配置
膠原酶溶液：100mg/mL 膠原酶I 用DMEM溶解為4mg/mL
10% FBS 的DMEM：10% FBS+1% Antibiotic+DMEM
5% FBS 的DMEM/Ham's F12：5% FBS+1% Antibiotic+DMEM
脫氧核酸核糖酶Ⅰ溶液：用PBS將脫氧核酸核糖酶Ⅰ溶解為1mg/mL
實(shí)驗(yàn)步驟
1、將組織轉(zhuǎn)移到15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用大量的PBS沖洗，以除去組織中殘留的血液和儲(chǔ)存的液體。吸去PBS，重復(fù)洗滌2次?？偣睬逑?次。
2、使用鋒利的手刀片將清洗后的組織切成2-3mm大小的碎片，在此過程中去取殘留的脂肪組織，從而避免影響消化的效率。
3、將約20mL的組織轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入20mL DMEM（含有5%FBS和4mg/mL膠原蛋白酶Ⅰ），將試管放在搖床上以180-200轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速攪拌12-16小時(shí)，保持溫度在37℃。
4、攪拌結(jié)束后使用離心機(jī)，400g離心5分鐘。去上清后使用50mL PBS洗滌，400g離心5分鐘后去PBS。
5、在離心后的類器官顆粒中加入2mL濃度為0.05%的胰酶，37℃靜置消化6分鐘，每2分鐘取出試管上下?lián)u晃一次，總計(jì)3次。
6、加入含10mL 10%FBS的DMEM，400g離心5分鐘，去上清，用1ml含10%FBS的DMEM重懸。
7、加入100μL DNase，消化5分鐘，加入10mL 10%FBS的DMEM，400g離心5分鐘，去上清，用10ml含10%FBS的DMEM重懸。
8、檢測(cè)細(xì)胞活性，活性在85%以上可用于后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)。
制備結(jié)果
注意：盡量選取新鮮樣品進(jìn)行操作，組織離體時(shí)間多長(zhǎng)細(xì)胞容易死亡。影響最終的實(shí)驗(yàn)效果。
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