大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
發(fā)布時(shí)間：2025-07-04 瀏覽次數(shù)：17
大腸桿菌宿主菌株作為受體細(xì)胞，當(dāng)這些受體細(xì)胞經(jīng)過(CaCl2)處理時(shí)，它們的細(xì)胞膜通透性會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的改變，從而成為能夠允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。
一、感受態(tài)細(xì)胞
1.感受態(tài)：受體細(xì)胞最容易接受外源基因并將其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。
2.感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞通過理化方法處理，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)的細(xì)胞。
3.感受態(tài)菌齡：細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)和實(shí)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。
4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA或以他為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。
二、感受態(tài)細(xì)胞制備的原理
1.外源基因表達(dá)的條件：重組質(zhì)粒必須通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，才能進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量的克隆基因。
2.感受態(tài)制備原理：將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫0℃預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹（滲透作用），同時(shí)，Ca2+會(huì)使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導(dǎo)細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞。
3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理：感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復(fù)合物。將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激90s，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨機(jī)出現(xiàn)許多間隙，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。
4.外源基因表達(dá)：進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上（相應(yīng)抗生素抗性）培養(yǎng)，篩選出帶有外源DNA分子的陽性克隆。
三、感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法）
1. 受體菌種活化：取-80℃冰箱中保藏的菌株（如DH5α、Top10、DE3、BL21等）在LB平板（無抗性）上劃線分離，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
2. 受體菌培養(yǎng)：從LB平板上挑取單菌落，接種于10mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12h左右至對數(shù)生長中后期。
3. 菌種的準(zhǔn)備：將受體菌菌懸液以2%的接種量接種于裝有20mL LB液體培養(yǎng)基（無抗性）中，37℃震蕩培養(yǎng)大約2-3h至OD600=0.4-0.5，菌落數(shù)＜108cfu/mL。
4. 感受態(tài)細(xì)胞的制備：
(1)離心：把上述菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，冰浴10min，在4℃，3000r/min，離心10min。
(2)重懸冰?。?/strong>棄上清液，加入10mL預(yù)冷的0.05M 的CaCl2溶液，輕輕混勻，冰浴30min后，在4℃，3000r/min，離心10min。
(3)重懸：棄上清，加入6mL預(yù)冷的含15%甘油的0.05MCaCl2溶液，輕輕混勻，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液?；驐壣锨?，加入6mL預(yù)冷0.05MCaCl2溶液，輕輕混勻，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液，直接使用。
(4)分裝：用移液槍分裝重懸液至1.5mL離心管中，每個(gè)離心管中分裝50μL懸浮液。
(5)保藏：標(biāo)記貼標(biāo)簽，使之迅速冷凍，-80℃保藏備用。
五、質(zhì)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化
1.取感受態(tài)：如果感受態(tài)細(xì)胞保藏于-80℃，從-80℃冰箱中取一支感受態(tài)，室溫下解凍后立即冰?。蝗绻惺軕B(tài)細(xì)胞沒有保藏，可以直接用于轉(zhuǎn)化。
2.質(zhì)粒處理：一般質(zhì)粒為粉末，1ng質(zhì)粒添加10μL緩沖液或蒸餾水，混勻。
3.轉(zhuǎn)化：在含有50μL感受態(tài)細(xì)胞的離心管中加入1μL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒充分混勻，冰上靜置30min。
4.熱擊：將離心管置于42℃熱擊60-90s，然后迅速冰浴，使細(xì)胞冷卻2-3 min。
5.培養(yǎng)：向離心管中加入已預(yù)熱的無菌LB培養(yǎng)基（無抗性）300μL，150rpm、37℃恒溫震蕩培養(yǎng)45min。
6.涂布：吸取100μL菌液于LB固體培養(yǎng)基上（含抗性），用涂布器均勻涂布，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16h。
7.轉(zhuǎn)化率計(jì)算：
轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化效率，公式如下：
轉(zhuǎn)化總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積
轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量μg
理論上轉(zhuǎn)化率最高為每微克的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌落數(shù)為1×1010 。
六、注意事項(xiàng)
1. 嚴(yán)格無菌操作
操作過程，注意進(jìn)行無菌操作，避免環(huán)境中雜菌污染。
2.嚴(yán)格控制溫度
操作過程，要注意操作溫度，以保持細(xì)胞的狀態(tài)；
加入抗生素時(shí)注意溫度，避免過高溫度導(dǎo)致抗生素失活。
3. 嚴(yán)格控制濃度
嚴(yán)格控制細(xì)胞的生長階段和菌濃，嚴(yán)格控制質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度，以提高轉(zhuǎn)化效率。
4. 計(jì)算轉(zhuǎn)化率
記錄和計(jì)算轉(zhuǎn)化率的指標(biāo)如轉(zhuǎn)化子總數(shù)、感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率以評估轉(zhuǎn)化效率。
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