摘 要：本試驗(yàn)從一群糊肛嚴(yán)重、死淘率和跛腳雞高達(dá)2%的雞群中，隨機(jī)挑精神狀態(tài)差、瘦小、糊肛嚴(yán)重、跛腳的雞若干，采集其肝臟和關(guān)節(jié)進(jìn)行沙門氏菌的分離與鑒定。成功分到10株雞白痢沙門氏菌，其中6株源自肝臟，4株源自關(guān)節(jié)；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，10株雞白痢沙門氏菌對(duì)頭孢噻呋鈉、卡那霉素、慶大霉素、硫酸新霉素、復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪和氧氟沙星可溶性粉均表現(xiàn)出高度敏感，但對(duì)阿莫西林、氨芐西林可溶性粉、鹽酸林可霉素、酒石酸泰樂菌素、鹽酸土霉素可溶性粉等呈多重耐藥。因此，對(duì)雞白痢沙門菌的治療應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果篩選敏感藥物指導(dǎo)臨床科學(xué)合理用藥。
關(guān)鍵詞：雞白痢沙門氏菌；分離鑒定；耐藥性
雞白痢沙門氏菌具有宿主高度適應(yīng)專一性的特點(diǎn)，引起雛雞精神萎靡、下痢甚至死亡，發(fā)病率和死亡率都很高；成年雞亦可被感染，常導(dǎo)致產(chǎn)蛋率、孵化率和出雛率下降，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞生產(chǎn)的重要疾病之一［12］。我國自20世紀(jì)80年代便開始實(shí)行大規(guī)模雞白痢凈化方案，但因各雞場(chǎng)規(guī)模、品種、基礎(chǔ)設(shè)施和人員素質(zhì)參差不齊，導(dǎo)致白痢陽性率居高不下［3］。此外，我國地方品種雞和黃羽肉雞白痢抗體水平顯著高于引種雞和培育蛋雞品種，由于抗體陽性率與病原陽性率并不一致，即使種雞場(chǎng)采用淘汰抗體陽性雞的措施來防控雞白痢，效果也并不顯著，而藥物治療極易產(chǎn)生耐藥性［45］，因此，雞白痢沙門氏菌給雞場(chǎng)健康養(yǎng)殖造成極大困擾。
本研究從一群死淘率和跛腳率均較高的竹絲雞中分離并鑒定沙門氏菌，通過藥物敏感性試驗(yàn)篩選敏感藥物，為生產(chǎn)上查找雞群前期死淘率和跛腳率較高的原因以及指導(dǎo)臨床用藥提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 病料來源
前期死淘率和跛腳率較高的竹絲雞，無菌采集精神狀態(tài)差、瘦小、糊肛嚴(yán)重、跛腳雞的肝臟和關(guān)節(jié)。
1.2 培養(yǎng)基和試劑
亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基、XLT4瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱營養(yǎng)瓊脂、沙門氏菌的生化鑒定盒等均購自廣東環(huán)凱生物科技公司；Ex Taq 酶購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；氨芐西林可溶性粉購自拜耳（四川）動(dòng)物保健有限公司，氟甲喹購自河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，鹽酸林可霉素、復(fù)方磺胺嘧啶混懸液和氧氟沙星可溶性粉購自江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司，頭孢噻呋鈉、阿莫西林可溶性粉等16種藥物均購自廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司。
1.3 細(xì)菌分離
無菌取竹絲雞的肝臟和關(guān)節(jié)，剪碎后分別接至亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）37 ℃增菌培養(yǎng)24 h，取一環(huán)增菌液劃線接種于沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基，置 于37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取疑似沙門氏菌的單菌落分別接種于XLT4培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況和形態(tài)。
1.4 革蘭氏染色
取純化好的單菌落以適量生理鹽水稀釋，將菌懸液涂片固定后，滴加結(jié)晶紫初染1 min，水洗；碘液媒染 1 min，水洗；酒精脫碘 30 s，水洗；蕃紅復(fù)染1 min，水洗；晾干，于顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)。
1.5 生化鑒定
取適量菌液分別接種于沙門氏菌的生化鑒定管中（三糖鐵、蛋白胨水、尿素、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶、甘露醇、山梨醇、β半乳糖苷、衛(wèi)矛醇），37 ℃培 養(yǎng)24 h后觀察并記錄結(jié)果。
1.6 PCR鑒定
根據(jù)雞白痢沙門氏菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增［6］，20 μL 反應(yīng)體系：Ex Taq 酶 10 μL，無菌水8 μL，上下游引物各0.5 μL，菌液1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延 伸 30 s，30 個(gè) 循 環(huán) ；72 ℃ 后 延 伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段為161 bp。
1.7 藥敏試驗(yàn)
取鑒定后的雞白痢沙門氏菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h后，取細(xì)菌懸液均勻涂布在TSA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，采用牛津杯法對(duì)21種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)16～18 h量取抑菌圈。
2 結(jié)果
2.1 細(xì)菌分離結(jié)果
分離株在沙門氏菌顯色瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)成圓形、光滑突起的紫紅色菌落，在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、無色透明的菌落，在SS瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形、光滑、無色半透明的菌落，在麥康凱培養(yǎng)上顯現(xiàn)圓形、光滑、露珠狀、無色透明的菌落。分離菌株經(jīng)革蘭氏染色后，在油鏡下觀察到兩端鈍圓的紅色短小桿菌，呈革蘭氏陰性（圖1，圖見第52頁）。
2.2 鑒定結(jié)果
生化試驗(yàn)結(jié)果表明分離株在三糖鐵瓊脂（TSI）試驗(yàn)中均產(chǎn)酸、斜面變紅，蛋白胨、尿素、氰化鉀、山梨醇、衛(wèi)矛醇和β半乳糖苷酶試驗(yàn)均為陰性，甘露醇和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性，參照生化鑒定試劑盒說明書判斷所有分離株均為沙門氏菌；將分離株進(jìn)行雞白痢沙門氏菌特異性 PCR 擴(kuò)增，分離株均能擴(kuò)增到目的片段（圖2）；綜合生化試驗(yàn)和PCR鑒定結(jié)果，本研究從病雞肝臟和關(guān)節(jié)樣品中共分離鑒定 10 株雞白痢沙門氏菌，其中 6 株分離自肝臟、4株分離自關(guān)節(jié)。
2.3 10藥敏試驗(yàn)結(jié)果
株雞白痢沙門氏菌對(duì)21種藥物的敏感性判定參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ NCCLS，2009）公布的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明：10株雞白痢沙門氏菌對(duì)頭孢噻呋鈉、卡那霉素、慶大霉素、硫酸新霉素、復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪和氧氟沙星可溶性粉均表現(xiàn)出高度敏感，對(duì)阿莫西林、氨芐西林可溶性粉、鹽酸林可霉素、酒石酸泰樂菌素、鹽酸土霉素可溶性粉等均耐藥，對(duì)其余 10 種藥物的敏感性具有差異（表 1）。
3 討論
雞白痢是由雞白痢沙門氏菌引起的一種急性系統(tǒng)性疾病，傳染速度較快、發(fā)病率高，可引起種蛋受精率、孵化率和健苗率降低，死胚率、弱胚率和弱雛率升高，還可導(dǎo)致繼發(fā)感染或混合感染［7］，嚴(yán)重制約養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。目前國內(nèi)雞白痢沙門氏菌并無有效的商品化疫苗，國內(nèi)種雞場(chǎng)主要采用抗菌藥物結(jié)合定期檢疫淘汰陽性雞的方法進(jìn)行雞白痢的防控［8］，但不同場(chǎng)的防控效果具有較大差異，且長(zhǎng)時(shí)間使用抗生素藥物容易導(dǎo)致耐藥性和藥物殘留等問題。
本研究通過細(xì)菌分離純化、染色鏡檢、生化試驗(yàn)和特異性PCR鑒定，成功從糊肛、跛腳、精神狀態(tài)差的竹絲雞中分離出10株雞白痢沙門氏菌，其中6株分離自肝臟，4株分離自腫脹的關(guān)節(jié)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，所有分離株對(duì)頭孢噻呋鈉、卡那霉素、慶大霉素、硫酸新霉素、復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪和氧氟沙星可溶性粉6種藥物均高度敏感，在臨床用藥時(shí)可作為首選，而對(duì)阿莫西林、氨芐西林可溶性粉、鹽酸林可霉素、酒石酸泰樂菌素、鹽酸土霉素可溶性粉具有多重耐藥性，對(duì)其他10種藥物的敏感性各菌株具有一定差異。由于各雞場(chǎng)和各地區(qū)用藥習(xí)慣和用藥頻率不同，導(dǎo)致藥敏試驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異［910］。因此，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感藥物，通過交替和輪換使用抗菌藥物，再配合科學(xué)的飼養(yǎng)管理，對(duì)臨床科學(xué)合理用藥具有重要的指導(dǎo)意義。
Guo等（2019）報(bào)道從跛腳、患有細(xì)菌性關(guān)節(jié)炎的商品雞中分離鑒定雞白痢沙門氏菌，并成功復(fù)制關(guān)節(jié)炎病例，說明病原的多樣化程度越來越高，一些新型沙門氏菌能夠誘發(fā)雞關(guān)節(jié)炎［11］。本研究中雞群早期跛腳率高、死淘嚴(yán)重是否由于感染關(guān)節(jié)型還是肝臟型雞白痢沙門氏菌引起，還需要后期通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
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來源：廣東畜牧獸醫(yī)科技
原文標(biāo)題：2021年度“永順杯”——雞白痢沙門氏菌的分離鑒定與藥敏試
