小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)
發(fā)布時間：2023-05-23 瀏覽次數(shù)：810
小鼠胚胎成纖維細胞(MEF) 作為原代培養(yǎng)細胞，其刺激增殖的能力強且可靠、易培養(yǎng)、來源豐富，常被用作干細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。一方面提供刺激干細胞增殖的各種因子，另一方面保持干細胞的未分化狀態(tài)。雖然MEF 傳代次數(shù)有限，但可早期凍存一些，不斷復(fù)蘇，保持長期使用。MEF 的缺點是無法耐受G418 的篩選。替代方法是從持續(xù)表達neo 抗性的小鼠品系或轉(zhuǎn)基因品系來分離培養(yǎng)MEF 。利用各種轉(zhuǎn)基因鼠培養(yǎng)的MEF 細胞還是各種基因功能研究的良好工具。
一 材 料
12.5~14.5d 的小鼠胚胎(3~6 只小鼠／次）
培養(yǎng)皿（ 直徑10cm)
DMEM+10%新生牛血清
15cm 或50cm 離心管（圓底）
PBS 配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液
手術(shù)刀、鑷子、剪子等器械。
二 操作步驟
1. 一般操作
(1) 在培養(yǎng)皿中，解剖出鼠胚，以Hanks 溶液消洗。
(2) 除掉四肢、大腦及內(nèi)臟（肝臟） 。
(3) 用無菌Hanks 溶液＋PBS 漂洗3 次。
(4) 置培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪切碎。
(5) 將剪碎組織移入50ml 離心管中，加入約10ml 消化液。
(6) 37°C搖育10min （置水浴或孵育箱中）。
(7) 吸5ml 上清液放入另一50ml 離心管中，加等體積含10％新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中和胰蛋白酶。
(8) 再加入4ml 消化液至原離心管（內(nèi)含組織），顛倒搖動，10min 后再吸出5ml 上清液到另一離心管中，加入5ml 含10% 新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。
(9) 重復(fù)上一步驟 5次左右，此時離心管中僅剩無法消化的軟骨等。
(10) 離心50ml 離心管，加50ml 含10％新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。
(11) 取適量移到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
(12) 第二天換液，直到細胞長滿（匯合），1 : 10 傳代，再生長至合適密度時可進行凍存。
(13) 根據(jù)實驗需要復(fù)蘇細胞，由于MEF細胞傳代數(shù)有限，實驗時應(yīng)盡可能保留相同代數(shù)的細胞進行平行實驗。
2. 絲裂霉素處理或γ-射線處理 用作飼養(yǎng)層的MEF 細胞還須進行絲裂霉素處理或干射線處理，步驟如下。
（1） 絲裂霉素處理
① 復(fù)蘇凍存的MEF 細胞(5×104 個/cm2，保證用時滿滿一層，不留空間。
② 匯合狀態(tài)下的MEF 加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml 絲裂霉素的DMEM 培養(yǎng)液， 37 °C 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3h 。
③ 以PBS 徹底漂洗數(shù)次，胰蛋白酶消化，以每分鐘1000 轉(zhuǎn)的速率離心5min,收集沉淀，用新培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整濃度為3×105g 個/ml。
④ 將細胞接種于經(jīng)明膠預(yù)處理的培養(yǎng)皿中。（明膠預(yù)處理：0.1％明膠溶液浸泡2h, 移走多余的明膠，待自然干燥。）
(2) γ-射線處理
① 匯合狀態(tài)的MEF 細胞，以30~ 100Gy 的γ－射線處理。
② 胰蛋白酶消化，收集細胞，離心（每分鐘1000 轉(zhuǎn)， 10min )、計數(shù)，接種到明膠預(yù)處理的培養(yǎng)皿中。
③ Y-射線處理過的細胞也可以5×106 個／ml 的濃度凍存起來。復(fù)蘇后， 1 支凍存管可接種到4~5 塊直徑6cm 的培養(yǎng)皿中。
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